葡萄糖-6-磷酸脫氫酶調(diào)控高糖所致的內(nèi)皮細胞氧化應激及功能異常的分子信號機制.pdf

1、本研究擬通過體內(nèi)外研究，針對G6PD是否參與及通過何種分子信號機制參與高糖所致的內(nèi)皮細胞氧化應激及功能異常的調(diào)控進行系統(tǒng)深入地探討，為闡明糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生機制及預防與應對措施提供理論及實驗依據(jù)。 第一章: G6PD參與調(diào)控高糖所致的內(nèi)皮細胞氧化應激的信號機制 目的: 探討G6PD在高糖導致的內(nèi)皮細胞氧化應激中的調(diào)控作用及其可能機制。 方法: 1.原代牛主動脈內(nèi)皮細胞在含10%熱滅活胎牛血清的DM

2、EM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)實驗需要隨機分組。各組細胞生長條件為：高葡萄糖處理組（25mmol/L），raffmose處理組（19.5mmol/L raffinose，5.5mmol/L葡萄糖）（raffinose作為葡萄糖的滲透壓對照），空白對照組（5.5mmol/L葡萄糖）。細胞在不同濃度葡萄糖條件下培養(yǎng)72小時后進行關于細胞氧化還原系統(tǒng)的各項指標的檢測。 2.高糖處理組、raffinose處理組和空白對照組在處理72小時后，以H

3、2DCFDA熒光標記法檢測ROS水平。另外，分別以0、10uM、100uM或1000uM H2O2處理BAEC30min，以H2DCFDA熒光標記法檢測ROS水平，以驗證此法檢測ROS產(chǎn)生的有效性。 3.高糖處理組、raffinose處理組和空白對照組在處理72小時后，檢測細胞內(nèi)8-Isoprostane、 TBARS的水平和GSH/GSSG含量比值。嚴格按試劑盒說明步驟檢測。 4.檢測各組細胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶、過氧化氫

4、酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、NADPH氧化酶酶的活性。其中GR、CAT、SOD、GPx活性按試劑盒說明步驟檢測。NOX活性檢測以酶生化方法進行。 5.檢測各組細胞內(nèi)G6PD活性和NADPH水平。G6PD活性以細胞內(nèi)NADPH的總產(chǎn)量減去6PGD產(chǎn)生的NADPH量表示。NADPH水平以本實驗室自行開發(fā)并被各實驗室廣泛使用的酶生化法進行。 6.構建含h-G6PD基因的質粒并通過腺病毒轉染在BAEC中表達。以Lac

5、Z基因作為對照。以western blot和免疫熒光法檢測BAEC中G6PD的含量，以酶生化法檢測細胞內(nèi)的G6PD活性。 7.以5.5mmol/L和25mmol/L，葡萄糖處理野生型BAEC細胞，以25mmol/L葡萄糖處理過表達G6PD和LacZ的BAEC細胞。處理時間均為72小時。檢測各組ROS水平，NADPH水平，GSH/GSSG含量比值以及GR、CAT、SOD的活性。 8.高糖處理組、raffinose處理組和空

6、白對照組在處理72小時后，檢測細胞內(nèi)cAMP含量。BAEC以不同濃度PKA（0，10u，20u，40u，80u）處理，檢測細胞內(nèi)G6PD活性。BAEC細胞以5.5mmol/L和25mmol/L葡萄糖處理，實驗終止前分別以20ummol/L Forskolin處理細胞2小時或以10 ummol/L PKI處理細胞3小時，檢測G6PD和NADPH活性。 9.BAEC細胞以5.5mmol/L和25mmol/L葡萄糖處理，實驗終止前分別

7、以20ummol/L Forskolin處理細胞2小時或以10 ummol/L PKI處理細胞3小時，分別檢測細胞內(nèi)GR、CAT、SOD、NOX的活性和GSH/GSSG的含量比值。 10.以5.5mmol/L和25mmol/L葡萄糖處理BAEC細胞，對BAEC進行G6PD和NOX gp91亞基熒光雙標記染色，以共聚焦顯微鏡觀察其是否存在G6PD與NOX的共定位。對25mmol/L葡萄糖處理BAEC細胞以10 ummol/L PK

8、I處理細胞3小時后以同樣方法檢測G6PD和NADPH氧化酶的共定位。 11.實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間資料比較用析因分析或單因素方差分析（ANOVA）檢驗，若差異有顯著性，任意兩組間比較當滿足方差齊性時用LSD法，不滿足方差齊性時用Dunnett’s T3法進行檢驗。檢驗標準α定為0.05。 結論: 1.高糖條件下內(nèi)皮細胞的氧化應激水平顯著升高：細胞

9、氧化還原系統(tǒng)中抗氧化酶活性降低，NADPH氧化酶活性升高。G6PD活性和NADPH水平均降低； 2.過表達G6PD能夠改善高糖導致的氧化應激，提高抗氧化酶的活性和細胞的抗氧化能力。 3.高糖通過cAMP依賴的PKA途徑影響G6PD的活性。 4.高糖條件下，G6PD和NADPH氧化酶通過細胞內(nèi)共定位導致NADPH氧化酶活性增高。 第二章: G6PD參與調(diào)控高糖所致的內(nèi)皮細胞一氧化氮生成減少的信號機制

10、 目的: 探討G6PD在高糖導致的內(nèi)皮細胞功能障礙中的作用及其可能機制。 方法: 1.BAEC培養(yǎng)方法基本同前。細胞無血清培養(yǎng)過夜后，以2%熱滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。BAEC以5.5mmol/L葡萄糖和25mmol/L葡萄糖分別處理1d，3d，5d和7d，測定細胞中的Nitrate和Nitrite水平。 2.細胞分為高葡萄糖處理組（25mmol/L），raffinose處理組（19.5mmol/

11、L raffinose，5.5mmol/L葡萄糖）和空白對照組（5.5mmol/L葡萄糖），培養(yǎng)7天后檢測NO水平（Nitrate/Nitrite和cGMP）。檢測前3小時以5umol/L Bradykinin干預細胞。Nitrate/Nitrite和cGMP的檢測嚴格按試劑盒說明步驟進行。BAEC細胞以上述同樣方法處理后檢測eNOS活性。eNOS活性檢測利用同位素3H標記的arginine進行測定。以1mM L-NAME或100uM

12、L-NMMA在檢測前3小時處理細胞，并檢測ROS水平。 3.高葡萄糖處理組（25mmol/L）和空白對照組（5.5mmol/L葡萄糖）的BAEC在培養(yǎng)7天后，Western blot檢測eNOS蛋白表達和eNOS Ser1177和Thr495位點的磷酸化修飾的變化。 4.BAEC以5.5mmol/L葡萄糖或25mM葡萄糖處理，時間為7d。在第3天時對25mM葡萄糖處理組利用腺病毒轉染G6PD或LacZ基因，以上述同樣方法

13、檢測NO水平（Nitrate/Nitrite和cGMP）、eNOS活性和eNOS蛋白表達和磷酸化修飾的變化。 5.實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組間比較用t檢驗。多組間資料比較用析因分析或單因素方差分析（ANOVA）檢驗，若差異有顯著性，任意兩組間比較當滿足方差齊性時用LSD法，不滿足方差齊性時用Dunnett's T3法進行檢驗。檢驗標準α定為0.05。 結論:

14、 1.高糖導致內(nèi)皮細胞內(nèi)NO水平的降低和eNOS活性下降；在高糖導致的氧化應激中eNOS成為細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的來源之一。 2.高糖通過改變eNOS的二聚體/單體比率和磷酸化位點修飾影響其活性。 3.過表達G6PD能夠改善eNOS的二聚體/單體比率及高糖對eNOS磷酸化修飾的影響，提高內(nèi)皮細胞NO水平和eNOS的活性。 第三章: G6PD基因缺陷小鼠糖尿病模型氧化應激水平的變化及相關機制的研究 目的:

15、 利用G6PD基因缺陷小鼠觀察動物實驗G6PD在糖尿病導致的氧化應激和內(nèi)皮細胞功能障礙中的作用及機制。 方法: 1.以雄性半合子G6PD基因缺陷小鼠（Pretsch）及其同系野生型雄性對照小鼠（C3H）為實驗對象。G6PD是位于X染色體的基因，而雄性后代為半合子突變?nèi)毕?。Prestch小鼠G6PD活性顯著低于同系野生型C3H小鼠。 2.小鼠在SPF條件下飼養(yǎng)。12周齡時Pretsch小鼠和野生小鼠隨機分為

16、非糖尿病組和糖尿病組。糖尿病組注射鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)糖尿?。?5mg/Kg體重溶于0.1M檸檬酸鹽溶液中），非糖尿病組僅注射同等劑量和濃度的檸檬酸鹽溶液。糖尿病組小鼠在注射STZ48小時后以血糖儀剪尾法檢測血糖，血糖高于13.9mmol/L者視為糖尿病造模成功。糖尿病發(fā)病小鼠隨機分為兩組-糖尿病組和胰島素治療組。胰島素治療組小鼠在血糖檢測48小時后皮下置insulin pellets，每天恒定釋放胰島素0.2U，持續(xù)40天。40天

17、后予以更換。監(jiān)測各組小鼠體重變化。 3.小鼠分別在糖尿病發(fā)病1W，8W，16W和24W處死，每組每個時間點分別處死5只小鼠，心臟穿刺取血，分離腎皮質置液氮中保存待檢。腎皮質超聲裂解后檢測G6PD，NADPH，TBARS，GR，SOD，CAT，cAMP和PKA，具體檢測方法同前兩章。 4.檢測小鼠腎皮質eNOS活性和cGMP水平。 結論: 1.糖尿病狀態(tài)下腎皮質的氧化應激水平顯著升高，G6PD活性和NADP