自噬介導(dǎo)的MCT1對(duì)人肝癌細(xì)胞能量代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肝癌是世界范圍內(nèi)十種最常見(jiàn)的實(shí)體型惡性腫痛之一，其死亡率占癌癥死亡原因的第二位。目前針對(duì)肝癌的治療卻往往得不到理想的效果。因此，提高肝癌的早期診斷及治療技術(shù)是目前需要解決的重大問(wèn)題。其中，尋找關(guān)鍵性分子并進(jìn)行功能研究成為生物學(xué)研究的重要方向之一。在肝癌的演變過(guò)程中，伴隨有細(xì)胞能量代謝方式的改變，即從氧化磷酸化到有氧糖酵解(Warburg效應(yīng))。而有氧糖酵解的強(qiáng)弱主要由糖酵解關(guān)鍵酶和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控，例如:葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1

2、(GLUT1)，單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MCT1)，丙酮酸激酶M2型(PKM2)等。研究認(rèn)為肝癌的迅速生長(zhǎng)以及細(xì)胞活性與其糖酵解狀態(tài)緊密相關(guān)。由于肝癌具有快速生長(zhǎng)增殖的特性，腫瘤微環(huán)境不能完全供給肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)所需能量，這導(dǎo)致其往往處于缺氧和低營(yíng)養(yǎng)的生長(zhǎng)環(huán)境下。目前，在低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下肝癌細(xì)胞是如何獲得充足的能量并維持其快速增殖這一現(xiàn)象的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。近來(lái)研究表明在缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏環(huán)境中，自噬對(duì)肝癌細(xì)胞是一種保護(hù)機(jī)制，自噬可以通過(guò)影響脂代謝促

3、進(jìn)肝癌細(xì)胞存活并維持其增殖。那么，作為肝癌主要供能途徑的糖代謝是否也受自噬的調(diào)控呢？自噬對(duì)糖代謝的調(diào)控是通過(guò)什么方式實(shí)現(xiàn)的呢？本課題擬通過(guò)westernblot，PCR等技術(shù)探索在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下自噬是否對(duì)肝癌能量代謝具有調(diào)控作用以及其具體機(jī)制為肝癌治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用western blot、免疫熒光、電子透射顯微鏡技術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞系HepG2，Bel-7402在饑餓狀態(tài)下及聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA

4、時(shí)的自噬水平;
　　2.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究在饑餓狀態(tài)下自噬對(duì)肝癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響;
　　3.應(yīng)用葡萄糖檢測(cè)試劑盒、乳酸檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)在饑餓狀態(tài)下自噬對(duì)肝癌細(xì)胞能量代謝的影響;
　　4.應(yīng)用real time-PCR，western blot檢測(cè)饑餓狀態(tài)下自噬對(duì)能量代謝關(guān)鍵酶及相關(guān)蛋白的影響;
　　5.應(yīng)用real time-PCR，western blot檢測(cè)饑餓狀態(tài)下自噬對(duì)CAV-1表達(dá)的影響;
　

5、　6.應(yīng)用EBSS培養(yǎng)細(xì)胞并轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CAV-1質(zhì)粒，檢測(cè)MCT1表達(dá);
　　7.免疫組化檢測(cè)肝癌及正常肝組織中LC3、MCT1表達(dá)并進(jìn)行臨床病理參數(shù)分析和相關(guān)性分析;
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用EBSS誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系饑餓后，肝癌細(xì)胞系HepG2、Bel-7402自噬明顯增強(qiáng);而聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA則可使其自噬水平降低;
　　2.在饑餓狀態(tài)下應(yīng)用自噬抑制劑能夠?qū)е赂伟┘?xì)胞系增殖減慢并發(fā)生凋亡現(xiàn)象;

6、
　　3.饑餓狀態(tài)下抑制自噬后，肝癌細(xì)胞系葡萄糖消耗及乳酸產(chǎn)生減少;提示自噬能夠影響肝癌細(xì)胞能量代謝;
　　4.饑餓誘導(dǎo)自噬后，肝癌細(xì)胞MCT1表達(dá)明顯增加;而聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA可以減少M(fèi)CT1表達(dá);
　　5.饑餓誘導(dǎo)自噬后肝癌細(xì)胞系CAV-1表達(dá)降低;
　　6.饑餓狀態(tài)下，過(guò)表達(dá)CAV-1后MCT1表達(dá)降低;
　　7.LC3、MCT1在肝癌組織中呈高表達(dá)，兩者呈正相關(guān);LC3、MCT1表達(dá)與肝癌的