右美托咪啶對(duì)熱射病小鼠的保護(hù)作用及基于腸道屏障的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　熱射病(Heatstroke，HS)，是一種由高體溫誘導(dǎo)的、由熱細(xì)胞毒作用、彌漫性血管內(nèi)凝血和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)共同導(dǎo)致的一種多器官功能障礙性疾病，發(fā)病急，累及器官多，目前臨床上尚缺乏特異性的防治藥物。研究發(fā)現(xiàn)，熱射病與膿毒癥的病理生理機(jī)制極其相似，腸道屏障損傷可導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，內(nèi)毒素入血后可促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，加重多器官損傷，在疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。基于此，腸道被認(rèn)為是熱射病等多種危重癥的

2、“發(fā)動(dòng)器官”。
　　右美托咪啶(Dexmedetomidine，DEX)是一種高選擇性旺2腎上腺素受體(Alpha2-adrenergic receptor，α2-AR)激動(dòng)劑，副作用小，具有無(wú)呼吸抑制、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)、抑制應(yīng)激反應(yīng)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于危重癥或圍手術(shù)期患者的鎮(zhèn)靜或麻醉等。據(jù)報(bào)道，DEX在臨床應(yīng)用過(guò)程中表現(xiàn)出顯著的抗炎和器官保護(hù)作用，如降低危重癥患者的炎性細(xì)胞因子水平，緩解患者的肝臟、腎臟、肺臟和腸道損傷等。諸多研究

3、已表明，DEX對(duì)膿毒癥有較好的治療作用，可降低患者的系統(tǒng)性炎癥水平，減輕臟器損傷，提高生存率，因此提出了DEX對(duì)病理生理機(jī)制與膿毒癥極其類似的熱射病也可能有治療作用的假設(shè)。近期研究發(fā)現(xiàn)，DEX可通過(guò)α2A-AR調(diào)節(jié)Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)及其相關(guān)信號(hào)通路的活化，介導(dǎo)抗炎、抗凋亡等作用，對(duì)腸道起保護(hù)作用;且有數(shù)據(jù)顯示，DEX的受體α2A-AR亞型在胃腸道高表達(dá)?；诖耍茰y(cè)DEX可能通過(guò)靶向腸道

4、，減輕腸道屏障損傷，抑制內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而對(duì)熱射病所致的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和多器官損傷起保護(hù)作用。
　　研究目的：
　　本課題主要研究DEX對(duì)熱射病小鼠系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和多器官損傷的保護(hù)作用，并基于腸道屏障從以下幾個(gè)方面研究其保護(hù)作用機(jī)制:(1)從腸道屏障的通透性、腸上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白、腸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等方面研究DEX對(duì)腸道屏障功能的影響;(2)從TLR4及其下游的核因子Kappa B(Nuclear FactorκB，NF-κ

5、B)通路、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor family,pyrin domain-containing protein3，NLRP3)炎癥小體和凋亡等角度研究DEX對(duì)小鼠腸道的抗炎和抗凋亡作用機(jī)制;(3)利用α2A-AR的拮抗劑BRL-44408進(jìn)行干預(yù)，以驗(yàn)證DEX對(duì)熱射病小鼠的保護(hù)作用是否與α2A-AR有關(guān)。
　　研究方法：
　　第一部分熱射病小鼠模型的建立
　　熱射病小鼠模

6、型的建立:利用高溫環(huán)境模擬艙建立成年雄性C57BL/6小鼠的熱射病模型，溫度為40±1℃，濕度為55±5％，待小鼠肛溫升至42.7℃（公認(rèn)的熱射病發(fā)生的標(biāo)志）時(shí)取出，室溫恢復(fù)。
　　分別于熱射病發(fā)生后2小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)麻醉解剖小鼠，檢測(cè)不同處理組的血清腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和IL-1β的水平，以確定最佳取樣時(shí)間，用于后

7、續(xù)研究。
　　小鼠經(jīng)麻醉解剖后，檢測(cè)肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）和堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)，腎功能指標(biāo)血清尿素(Bloodurea，BU)和肌酸酐（Creatinine，CREA），并通過(guò)檢測(cè)血漿內(nèi)毒素水平評(píng)價(jià)腸道損傷程度。取小鼠的主要器官如肝臟、腎臟、肺

8、臟、脾臟和腸道（回腸部分）等進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，評(píng)價(jià)熱射病小鼠的主要臟器損傷情況。
　　第二部分右美托咪啶對(duì)熱射病小鼠的保護(hù)作用研究
　　DEX對(duì)熱射病小鼠保護(hù)作用的量效關(guān)系研究:根據(jù)文獻(xiàn)資料和預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)5μg/kg、10μg/kg和25μg/kg三個(gè)劑量組，根據(jù)體表面積進(jìn)行等效劑量換算，分別相當(dāng)于臨床人用劑量的約0.5倍、1倍和2.5倍。以熱射病發(fā)生后的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β為檢測(cè)指標(biāo)，以確定最佳劑量

9、水平，用于后續(xù)研究。
　　DEX對(duì)熱射病小鼠多臟器損傷的保護(hù)作用研究:檢測(cè)肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)和腸道損傷指標(biāo);并對(duì)小鼠的主要臟器做病理組織學(xué)檢查。
　　DEX對(duì)熱射病小鼠腸道屏障的保護(hù)作用研究:通過(guò)FD4實(shí)驗(yàn)和D-乳酸水平的檢測(cè)評(píng)價(jià)小鼠腸道的通透性。并通過(guò)Western-blot(WB)和免疫組織化學(xué)手段分析腸道組織的緊密連接蛋白o(hù)ccludin和閉鎖小帶蛋白(Zonula occludens1，ZO-1)的表達(dá)。最后，利

10、用電鏡檢查技術(shù)對(duì)小鼠腸道細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢查。
　　第三部分右美托咪啶對(duì)熱射病小鼠腸道的保護(hù)機(jī)制研究
　　腸道TLR4相關(guān)炎癥信號(hào)通路的研究:首先，WB檢測(cè)小鼠腸道組織的α2A-AR和TLR4蛋白表達(dá)水平。其次，對(duì)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白p65亞基、磷酸化κB抑制因子α(Inhibitor ofκBα，IκBα)、磷酸化p65的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè);并通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察NF-κB p65的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移情況。然后，WB檢測(cè)腸道

11、組織的NLRP3、接頭蛋白ASC和caspase-1的活化成分p10的表達(dá)水平;并用免疫熒光技術(shù)分析NLRP3與IL-1β的表達(dá)情況。最后用qPCR手段檢測(cè)小鼠腸道炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平。
　　腸道細(xì)胞凋亡水平的檢查:通過(guò)WB手段分析腸道凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平;通過(guò)TUNEL免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析腸道細(xì)胞的凋亡水平。
　　最后，給予α2A-AR拮抗劑BRL-44408干預(yù)，分別檢測(cè)

12、腸道α2A-AR和TLR4的蛋白表達(dá)水平;腸道和血清的炎癥因子水平;并對(duì)小鼠的主要臟器做病理組織學(xué)檢查。
　　研究結(jié)果：
　　一、熱射病小鼠模型的建立
　　肛溫變化趨勢(shì):將10只小鼠置于溫度為40±1℃、濕度為55±5％的環(huán)境中處理218.0±19.9分鐘后，小鼠肛溫可達(dá)到42.7℃（熱射病發(fā)生的指標(biāo)），伴隨出現(xiàn)躁動(dòng)、皮毛潮濕、唾液分泌增加等癥狀，部分小鼠出現(xiàn)抽搐、精神萎靡甚至淺昏迷等癥狀。移出高溫艙后，小鼠的肛溫迅速

13、降低，80min～180min內(nèi)降至30.5±0.9℃，之后緩慢上升，約6小時(shí)后，肛溫升至36.9±0.8℃，小鼠狀態(tài)基本恢復(fù)至對(duì)照組小鼠(n=5)的水平。
　　血清炎癥因子檢測(cè):熱射病發(fā)生后2小時(shí)，小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高不明顯;熱射病發(fā)生后6小時(shí)，小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高明顯，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=8，P＜0.05);熱射病發(fā)生后24小時(shí)，小鼠血清炎癥因子水平基本回落至對(duì)照組

14、的水平。因此，后續(xù)均以熱射病發(fā)生后6小時(shí)為取樣時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　多器官損傷的檢查:熱射病小鼠肝臟主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹、透明或水樣變性，伴隨肝功能指標(biāo)ALT、AST和ALP的明顯升高;腎臟的皮質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)典型的透明管型變性，伴隨腎功能指標(biāo)BU和CREA的明顯升高;肺臟則出現(xiàn)明顯的間質(zhì)充血或血栓，偶見(jiàn)肺泡充血;脾臟的白髓區(qū)域出現(xiàn)明顯的巨噬細(xì)胞吞噬的細(xì)胞碎片形成的“星空現(xiàn)象”;腸道表現(xiàn)為明顯的中央乳糜管膨脹，固有粘膜層結(jié)構(gòu)紊亂，伴隨血

15、漿內(nèi)毒素水平的升高(n=8)。
　　經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)條件下，小鼠發(fā)生熱射病及其恢復(fù)過(guò)程中的溫度變化曲線比較穩(wěn)定，且熱射病發(fā)生后6小時(shí)，小鼠的血清炎癥因子水平升高明顯，伴隨出現(xiàn)肝臟、腎臟、脾臟、肺臟和腸道等多個(gè)器官的病理?yè)p傷，提示熱射病小鼠模型建立成功。
　　二、右美托咪啶對(duì)熱射病小鼠的保護(hù)作用研究
　　DEX的抗炎作用:DEX（5μg/kg、10μg/kg、25μg/kg）可劑量依賴地降低熱射病小鼠的血清

16、TNF-α和IL-6、IL-1β水平，且以25μg/kg劑量水平時(shí)的抗炎效果最為顯著，與HS組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=8，P＜0.05)，因此，后續(xù)均以此劑量進(jìn)行研究。
　　DEX的多器官保護(hù)作用:25μg/kg的DEX可降低熱射病小鼠的血清ALT、AST和ALP水平（n=6～8，P＜0.05或0.01），并緩解其肝細(xì)胞腫脹、透明或水樣變性等病理改變;DEX小鼠的血清BU和CREA水平低于HS組(P＜0.05或0.01)，其腎臟皮

17、質(zhì)區(qū)域的透明管型變性被改善;DEX對(duì)熱射病小鼠肺臟間質(zhì)充血或血栓、脾臟巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎片形成的“星空現(xiàn)象”等均有明顯的緩解作用;DEX還可減輕熱射病小鼠腸道的中央乳糜管膨脹，固有粘膜層結(jié)構(gòu)紊亂等病理改變，并降低血漿內(nèi)毒素水平。
　　DEX抑制腸道通透性的增加:FD4實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DEX降低了熱射病小鼠的血漿FD4水平，與HS組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，對(duì)腸道屏障功能的另一標(biāo)志物D-乳酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DEX可以顯著降低熱射病小鼠血漿D-

18、乳酸水平的升高(n=8，P＜0.05)。
　　DEX提高腸道緊密連接蛋白的表達(dá):DEX處理組小鼠腸道的緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)水平高于HS小鼠（n=6～8,P＜0.05）。
　　DEX保護(hù)腸道細(xì)胞超微結(jié)構(gòu):熱射病小鼠的回腸組織出現(xiàn)如下癥狀:腸道上皮細(xì)胞的微絨毛變短、脫落或被破壞;腸道上皮細(xì)胞間的緊密連接變得松散、空泡化或裂開(kāi)，導(dǎo)致細(xì)胞間出現(xiàn)不規(guī)則的間隙;細(xì)胞線粒體內(nèi)部出現(xiàn)腫脹、空泡化等特征，線粒體嵴模糊不

19、清，線粒體外膜膨脹。DEX處理組小鼠除了呈現(xiàn)輕微的線粒體腫脹和空泡化等特征外，其微絨毛、緊密連接等結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)至對(duì)照組小鼠的水平。
　　以上結(jié)果表明，DEX可通過(guò)提高腸道緊密連接蛋白的表達(dá)、維持腸道細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的完整性，減輕熱射病小鼠的腸道屏障損傷，因此本課題重點(diǎn)基于腸道屏障研究DEX對(duì)熱射病小鼠的保護(hù)作用機(jī)制。
　　三、右美托咪啶對(duì)熱射病小鼠腸道的保護(hù)機(jī)制研究
　　DEX對(duì)腸道α2A-AR和TLR4表達(dá)水平的影響:D

20、EX可提高熱射病小鼠腸道的α2A-AR表達(dá)水平，下調(diào)TLR4的表達(dá)水平（n=6～8，P＜0.05或P＜0.001）。
　　DEX抑制NF-κB信號(hào)通路:各組小鼠腸道的NF-κB p65的表達(dá)水平未發(fā)生明顯改變，而DEX降低了磷酸化IκBα和磷酸化NF-κB p65的水平，與HS組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=6～8)。免疫熒光結(jié)果顯示，DEX降低了熱射病小鼠的NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移水平。
　　DEX抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路:

21、DEX明顯降低了熱射病小鼠腸道的NLRP3、ASC和caspase-1p10表達(dá)水平，與HS組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;且DEX降低了熱射病小鼠腸道的NLRP3與IL-1β的熒光水平(n=6～8)。
　　DEX降低腸道炎癥因子水平:DEX可降低小鼠腸道TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平，與HS組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=6～8)。
　　DEX抑制腸道細(xì)胞凋亡:DEX提高了抗凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)了促凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá);

22、同時(shí)，DEX明顯降低了熱射病小鼠腸道的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的比例(n=6～8)。
　　DEX的作用與α2A-AR有關(guān):α2A-AR拮抗劑BRL-44408可部分逆轉(zhuǎn)DEX對(duì)熱射病小鼠腸道α2A-AR和TLR4表達(dá)水平的影響，上調(diào)腸道組織局部和血清中的炎癥因子水平，并部分抵消DEX對(duì)熱射病小鼠多器官病理組織損傷的保護(hù)作用(n=6～8)。
　　以上結(jié)果顯示，DEX對(duì)熱射病小鼠發(fā)揮腸道保護(hù)作用的機(jī)制有兩個(gè)方面:一方面，降低腸道TLR

23、4的表達(dá)，下調(diào)其下游的NF-κB和NLRP3信號(hào)的活化，進(jìn)而降低熱射病小鼠腸道局部的炎癥反應(yīng)水平;另一方面，DEX以一種Bax/Bcl-2依賴的方式下調(diào)了熱射病小鼠的腸道細(xì)胞凋亡水平。另外，DEX對(duì)熱射病小鼠的作用與α2A-AR有關(guān)。
　　研究結(jié)論：
　　1、在溫度為40±1℃、濕度為55±5％的條件下可成功誘導(dǎo)成年雄性C57BL/6小鼠的熱射病模型，其肛溫可達(dá)42.7℃。熱射病發(fā)生后6小時(shí)，小鼠出現(xiàn)明顯的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，伴

24、隨出現(xiàn)肝臟、腎臟、肺臟、脾臟和腸道等多器官損傷。
　　2、DEX可減輕熱射病小鼠的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和多器官損傷。
　　3、DEX可提高熱射病小鼠腸道的緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)，維持其超微結(jié)構(gòu)的完整性，保護(hù)其屏障功能，從而下調(diào)血漿內(nèi)毒素水平。
　　4、DEX對(duì)熱射病小鼠發(fā)揮腸道保護(hù)作用的機(jī)制:DEX可上調(diào)腸道α2A-AR的表達(dá)，降低TLR4的表達(dá)，從而下調(diào)TLR4下游的NF-κB和NLRP3炎癥小體信號(hào)