右美托咪啶對熱射病小鼠的保護作用及基于腸道屏障的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　熱射病(Heatstroke，HS)，是一種由高體溫誘導(dǎo)的、由熱細(xì)胞毒作用、彌漫性血管內(nèi)凝血和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)共同導(dǎo)致的一種多器官功能障礙性疾病，發(fā)病急，累及器官多，目前臨床上尚缺乏特異性的防治藥物。研究發(fā)現(xiàn)，熱射病與膿毒癥的病理生理機制極其相似，腸道屏障損傷可導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，內(nèi)毒素入血后可促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，加重多器官損傷，在疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用?；诖?，腸道被認(rèn)為是熱射病等多種危重癥的

2、“發(fā)動器官”。
　　右美托咪啶(Dexmedetomidine，DEX)是一種高選擇性旺2腎上腺素受體(Alpha2-adrenergic receptor，α2-AR)激動劑，副作用小，具有無呼吸抑制、穩(wěn)定血流動力學(xué)、抑制應(yīng)激反應(yīng)等特點，已廣泛應(yīng)用于危重癥或圍手術(shù)期患者的鎮(zhèn)靜或麻醉等。據(jù)報道，DEX在臨床應(yīng)用過程中表現(xiàn)出顯著的抗炎和器官保護作用，如降低危重癥患者的炎性細(xì)胞因子水平，緩解患者的肝臟、腎臟、肺臟和腸道損傷等。諸多研究

3、已表明，DEX對膿毒癥有較好的治療作用，可降低患者的系統(tǒng)性炎癥水平，減輕臟器損傷，提高生存率，因此提出了DEX對病理生理機制與膿毒癥極其類似的熱射病也可能有治療作用的假設(shè)。近期研究發(fā)現(xiàn)，DEX可通過α2A-AR調(diào)節(jié)Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)及其相關(guān)信號通路的活化，介導(dǎo)抗炎、抗凋亡等作用，對腸道起保護作用;且有數(shù)據(jù)顯示，DEX的受體α2A-AR亞型在胃腸道高表達(dá)?；诖?，推測DEX可能通過靶向腸道

4、，減輕腸道屏障損傷，抑制內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而對熱射病所致的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和多器官損傷起保護作用。
　　研究目的：
　　本課題主要研究DEX對熱射病小鼠系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和多器官損傷的保護作用，并基于腸道屏障從以下幾個方面研究其保護作用機制:(1)從腸道屏障的通透性、腸上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白、腸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等方面研究DEX對腸道屏障功能的影響;(2)從TLR4及其下游的核因子Kappa B(Nuclear FactorκB，NF-κ

5、B)通路、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor family,pyrin domain-containing protein3，NLRP3)炎癥小體和凋亡等角度研究DEX對小鼠腸道的抗炎和抗凋亡作用機制;(3)利用α2A-AR的拮抗劑BRL-44408進(jìn)行干預(yù)，以驗證DEX對熱射病小鼠的保護作用是否與α2A-AR有關(guān)。
　　研究方法：
　　第一部分熱射病小鼠模型的建立
　　熱射病小鼠模

6、型的建立:利用高溫環(huán)境模擬艙建立成年雄性C57BL/6小鼠的熱射病模型，溫度為40±1℃，濕度為55±5％，待小鼠肛溫升至42.7℃（公認(rèn)的熱射病發(fā)生的標(biāo)志）時取出，室溫恢復(fù)。
　　分別于熱射病發(fā)生后2小時、6小時和24小時麻醉解剖小鼠，檢測不同處理組的血清腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和IL-1β的水平，以確定最佳取樣時間，用于后

7、續(xù)研究。
　　小鼠經(jīng)麻醉解剖后，檢測肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）和堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)，腎功能指標(biāo)血清尿素(Bloodurea，BU)和肌酸酐（Creatinine，CREA），并通過檢測血漿內(nèi)毒素水平評價腸道損傷程度。取小鼠的主要器官如肝臟、腎臟、肺

8、臟、脾臟和腸道（回腸部分）等進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，評價熱射病小鼠的主要臟器損傷情況。
　　第二部分右美托咪啶對熱射病小鼠的保護作用研究
　　DEX對熱射病小鼠保護作用的量效關(guān)系研究:根據(jù)文獻(xiàn)資料和預(yù)實驗，分別設(shè)5μg/kg、10μg/kg和25μg/kg三個劑量組，根據(jù)體表面積進(jìn)行等效劑量換算，分別相當(dāng)于臨床人用劑量的約0.5倍、1倍和2.5倍。以熱射病發(fā)生后的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β為檢測指標(biāo)，以確定最佳劑量

9、水平，用于后續(xù)研究。
　　DEX對熱射病小鼠多臟器損傷的保護作用研究:檢測肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)和腸道損傷指標(biāo);并對小鼠的主要臟器做病理組織學(xué)檢查。
　　DEX對熱射病小鼠腸道屏障的保護作用研究:通過FD4實驗和D-乳酸水平的檢測評價小鼠腸道的通透性。并通過Western-blot(WB)和免疫組織化學(xué)手段分析腸道組織的緊密連接蛋白occludin和閉鎖小帶蛋白(Zonula occludens1，ZO-1)的表達(dá)。最后，利

10、用電鏡檢查技術(shù)對小鼠腸道細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢查。
　　第三部分右美托咪啶對熱射病小鼠腸道的保護機制研究
　　腸道TLR4相關(guān)炎癥信號通路的研究:首先，WB檢測小鼠腸道組織的α2A-AR和TLR4蛋白表達(dá)水平。其次，對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白p65亞基、磷酸化κB抑制因子α(Inhibitor ofκBα，IκBα)、磷酸化p65的表達(dá)水平進(jìn)行檢測;并通過免疫熒光實驗觀察NF-κB p65的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移情況。然后，WB檢測腸道

11、組織的NLRP3、接頭蛋白ASC和caspase-1的活化成分p10的表達(dá)水平;并用免疫熒光技術(shù)分析NLRP3與IL-1β的表達(dá)情況。最后用qPCR手段檢測小鼠腸道炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平。
　　腸道細(xì)胞凋亡水平的檢查:通過WB手段分析腸道凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平;通過TUNEL免疫熒光實驗分析腸道細(xì)胞的凋亡水平。
　　最后，給予α2A-AR拮抗劑BRL-44408干預(yù)，分別檢測

12、腸道α2A-AR和TLR4的蛋白表達(dá)水平;腸道和血清的炎癥因子水平;并對小鼠的主要臟器做病理組織學(xué)檢查。
　　研究結(jié)果：
　　一、熱射病小鼠模型的建立
　　肛溫變化趨勢:將10只小鼠置于溫度為40±1℃、濕度為55±5％的環(huán)境中處理218.0±19.9分鐘后，小鼠肛溫可達(dá)到42.7℃（熱射病發(fā)生的指標(biāo)），伴隨出現(xiàn)躁動、皮毛潮濕、唾液分泌增加等癥狀，部分小鼠出現(xiàn)抽搐、精神萎靡甚至淺昏迷等癥狀。移出高溫艙后，小鼠的肛溫迅速

13、降低，80min～180min內(nèi)降至30.5±0.9℃，之后緩慢上升，約6小時后，肛溫升至36.9±0.8℃，小鼠狀態(tài)基本恢復(fù)至對照組小鼠(n=5)的水平。
　　血清炎癥因子檢測:熱射病發(fā)生后2小時，小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高不明顯;熱射病發(fā)生后6小時，小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高明顯，與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(n=8，P＜0.05);熱射病發(fā)生后24小時，小鼠血清炎癥因子水平基本回落至對照組

14、的水平。因此，后續(xù)均以熱射病發(fā)生后6小時為取樣時間點進(jìn)行實驗。
　　多器官損傷的檢查:熱射病小鼠肝臟主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹、透明或水樣變性，伴隨肝功能指標(biāo)ALT、AST和ALP的明顯升高;腎臟的皮質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)典型的透明管型變性，伴隨腎功能指標(biāo)BU和CREA的明顯升高;肺臟則出現(xiàn)明顯的間質(zhì)充血或血栓，偶見肺泡充血;脾臟的白髓區(qū)域出現(xiàn)明顯的巨噬細(xì)胞吞噬的細(xì)胞碎片形成的“星空現(xiàn)象”;腸道表現(xiàn)為明顯的中央乳糜管膨脹，固有粘膜層結(jié)構(gòu)紊亂，伴隨血

15、漿內(nèi)毒素水平的升高(n=8)。
　　經(jīng)過多次重復(fù)實驗，發(fā)現(xiàn)在本實驗條件下，小鼠發(fā)生熱射病及其恢復(fù)過程中的溫度變化曲線比較穩(wěn)定，且熱射病發(fā)生后6小時，小鼠的血清炎癥因子水平升高明顯，伴隨出現(xiàn)肝臟、腎臟、脾臟、肺臟和腸道等多個器官的病理損傷，提示熱射病小鼠模型建立成功。
　　二、右美托咪啶對熱射病小鼠的保護作用研究
　　DEX的抗炎作用:DEX（5μg/kg、10μg/kg、25μg/kg）可劑量依賴地降低熱射病小鼠的血清

16、TNF-α和IL-6、IL-1β水平，且以25μg/kg劑量水平時的抗炎效果最為顯著，與HS組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(n=8，P＜0.05)，因此，后續(xù)均以此劑量進(jìn)行研究。
　　DEX的多器官保護作用:25μg/kg的DEX可降低熱射病小鼠的血清ALT、AST和ALP水平（n=6～8，P＜0.05或0.01），并緩解其肝細(xì)胞腫脹、透明或水樣變性等病理改變;DEX小鼠的血清BU和CREA水平低于HS組(P＜0.05或0.01)，其腎臟皮

17、質(zhì)區(qū)域的透明管型變性被改善;DEX對熱射病小鼠肺臟間質(zhì)充血或血栓、脾臟巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎片形成的“星空現(xiàn)象”等均有明顯的緩解作用;DEX還可減輕熱射病小鼠腸道的中央乳糜管膨脹，固有粘膜層結(jié)構(gòu)紊亂等病理改變，并降低血漿內(nèi)毒素水平。
　　DEX抑制腸道通透性的增加:FD4實驗結(jié)果顯示，DEX降低了熱射病小鼠的血漿FD4水平，與HS組有統(tǒng)計學(xué)差異。同時，對腸道屏障功能的另一標(biāo)志物D-乳酸進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)DEX可以顯著降低熱射病小鼠血漿D-

18、乳酸水平的升高(n=8，P＜0.05)。
　　DEX提高腸道緊密連接蛋白的表達(dá):DEX處理組小鼠腸道的緊密連接蛋白occludin和ZO-1的表達(dá)水平高于HS小鼠（n=6～8,P＜0.05）。
　　DEX保護腸道細(xì)胞超微結(jié)構(gòu):熱射病小鼠的回腸組織出現(xiàn)如下癥狀:腸道上皮細(xì)胞的微絨毛變短、脫落或被破壞;腸道上皮細(xì)胞間的緊密連接變得松散、空泡化或裂開，導(dǎo)致細(xì)胞間出現(xiàn)不規(guī)則的間隙;細(xì)胞線粒體內(nèi)部出現(xiàn)腫脹、空泡化等特征，線粒體嵴模糊不

19、清，線粒體外膜膨脹。DEX處理組小鼠除了呈現(xiàn)輕微的線粒體腫脹和空泡化等特征外，其微絨毛、緊密連接等結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)至對照組小鼠的水平。
　　以上結(jié)果表明，DEX可通過提高腸道緊密連接蛋白的表達(dá)、維持腸道細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的完整性，減輕熱射病小鼠的腸道屏障損傷，因此本課題重點基于腸道屏障研究DEX對熱射病小鼠的保護作用機制。
　　三、右美托咪啶對熱射病小鼠腸道的保護機制研究
　　DEX對腸道α2A-AR和TLR4表達(dá)水平的影響:D

20、EX可提高熱射病小鼠腸道的α2A-AR表達(dá)水平，下調(diào)TLR4的表達(dá)水平（n=6～8，P＜0.05或P＜0.001）。
　　DEX抑制NF-κB信號通路:各組小鼠腸道的NF-κB p65的表達(dá)水平未發(fā)生明顯改變，而DEX降低了磷酸化IκBα和磷酸化NF-κB p65的水平，與HS組比有統(tǒng)計學(xué)差異(n=6～8)。免疫熒光結(jié)果顯示，DEX降低了熱射病小鼠的NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移水平。
　　DEX抑制NLRP3炎癥小體信號通路:

21、DEX明顯降低了熱射病小鼠腸道的NLRP3、ASC和caspase-1p10表達(dá)水平，與HS組比有統(tǒng)計學(xué)差異;且DEX降低了熱射病小鼠腸道的NLRP3與IL-1β的熒光水平(n=6～8)。
　　DEX降低腸道炎癥因子水平:DEX可降低小鼠腸道TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平，與HS組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(n=6～8)。
　　DEX抑制腸道細(xì)胞凋亡:DEX提高了抗凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)了促凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá);

22、同時，DEX明顯降低了熱射病小鼠腸道的TUNEL陽性細(xì)胞的比例(n=6～8)。
　　DEX的作用與α2A-AR有關(guān):α2A-AR拮抗劑BRL-44408可部分逆轉(zhuǎn)DEX對熱射病小鼠腸道α2A-AR和TLR4表達(dá)水平的影響，上調(diào)腸道組織局部和血清中的炎癥因子水平，并部分抵消DEX對熱射病小鼠多器官病理組織損傷的保護作用(n=6～8)。
　　以上結(jié)果顯示，DEX對熱射病小鼠發(fā)揮腸道保護作用的機制有兩個方面:一方面，降低腸道TLR

23、4的表達(dá)，下調(diào)其下游的NF-κB和NLRP3信號的活化，進(jìn)而降低熱射病小鼠腸道局部的炎癥反應(yīng)水平;另一方面，DEX以一種Bax/Bcl-2依賴的方式下調(diào)了熱射病小鼠的腸道細(xì)胞凋亡水平。另外，DEX對熱射病小鼠的作用與α2A-AR有關(guān)。
　　研究結(jié)論：
　　1、在溫度為40±1℃、濕度為55±5％的條件下可成功誘導(dǎo)成年雄性C57BL/6小鼠的熱射病模型，其肛溫可達(dá)42.7℃。熱射病發(fā)生后6小時，小鼠出現(xiàn)明顯的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，伴

24、隨出現(xiàn)肝臟、腎臟、肺臟、脾臟和腸道等多器官損傷。
　　2、DEX可減輕熱射病小鼠的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和多器官損傷。
　　3、DEX可提高熱射病小鼠腸道的緊密連接蛋白occludin和ZO-1的表達(dá)，維持其超微結(jié)構(gòu)的完整性，保護其屏障功能，從而下調(diào)血漿內(nèi)毒素水平。
　　4、DEX對熱射病小鼠發(fā)揮腸道保護作用的機制:DEX可上調(diào)腸道α2A-AR的表達(dá)，降低TLR4的表達(dá)，從而下調(diào)TLR4下游的NF-κB和NLRP3炎癥小體信號