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文檔簡介
1、卵巢癌(Ovarian cancer, OC)是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而高居第三位。但因其缺乏早期特異性癥狀以及有效的篩查手段,70%的病人在首次就診時已是晚期,治療難度大、復發(fā)率高、轉(zhuǎn)移快,是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤死亡率最高的腫瘤。手術治療和以紫杉醇、順鉑等為主的聯(lián)合化療方案一定程度上改善了患者的預后,但治療過程中產(chǎn)生的化療耐藥令卵巢癌的5年生存率始終徘徊在30-40%左右,是婦科腫瘤醫(yī)生和研究人
2、員面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。
腫瘤的多藥耐藥(Multi-drug resistance, MDR)是指腫瘤細胞在接觸一種抗腫瘤藥產(chǎn)生耐藥性后,對未接觸過的、結構不同、作用機制各異的其他抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。腫瘤的多藥耐藥機制產(chǎn)生復雜,一個重要原因就是轉(zhuǎn)運體 P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)細胞內(nèi)藥物外排。P-gp利用細胞內(nèi)的三磷酸腺苷(ATP)將多種細胞毒性藥物排出細胞外,增加了腫瘤細胞對藥物的抵抗性,從而使腫
3、瘤細胞耐藥。多年來,圍繞MDR1/P-gp為靶標的逆轉(zhuǎn)耐藥研究,包括使用P-gp的競爭性抑制劑、單克隆抗體、反義寡核苷酸技術、RNA干擾技術等開始嶄露頭角,但多藥耐藥的形成是一個多基因、多因素的復雜的過程,靶向治療涉及的非特異性、副作用、安全、經(jīng)濟等問題限制了其應用。因此探索新的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的途徑、逆轉(zhuǎn)耐藥成為卵巢癌治療的熱點和難點。
我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥博大精深,近年來,從傳統(tǒng)中藥及天然植物中提取的多種抗腫瘤成分已被證實為有效
4、的抗腫瘤制劑。柚皮苷(Naringin)全稱為柚皮素新橙皮糖苷,是一種雙氫黃酮類化合物,主要存在于蕓香科植物,如柚子、葡萄柚、酸橙及其變種的果皮中,具有資源豐富、化學結構清晰、原材料價格低廉的優(yōu)勢?,F(xiàn)有研究表明,柚皮苷具有抗癌、抗炎、預防動脈粥樣硬化等藥理作用。與其他黃酮類化合物一樣,柚皮苷也具有抗腫瘤作用,對常見的腫瘤如乳腺癌、結腸癌、膀胱癌及肝癌等均具有有效的抗癌作用,在婦科惡性腫瘤中的研究尚少見。本課題組的前期結果提示:柚皮苷能明
5、顯抑制人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3細胞體外增殖,且隨著藥物作用時間的延長和濃度增大,柚皮苷對卵巢癌增殖抑制率逐漸增大。進一步研究顯示:柚皮苷對人上皮性卵巢癌耐順鉑(DDP)細胞株SKOV3/DDP細胞的體外增殖亦具有明顯抑制作用,并能增強SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性,其逆轉(zhuǎn)耐藥的機制可能與下調(diào)多藥耐藥基因MDR1及多藥耐藥相關蛋白MRP2基因的表達有關,為證實柚皮苷在卵巢癌抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性的作用提供了初步的思路。
6、 近年來研究顯示,核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κappaB NF-κB)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移均有密切的關系,它所編碼的許多蛋白能促進腫瘤生長;順鉑耐藥卵巢癌細胞中NF-κB持續(xù)高表達,且其在卵巢癌細胞耐藥機制中處于核心地位;NF-κB通過調(diào)節(jié)下游靶蛋白Bcl-xL、Bcl-2、Fas/FasL、XIAP、survivin、cIAP1/2、CDK2、VEGF、COX-2等發(fā)揮抗凋亡作用,令腫瘤細胞生存能力增強,最
7、終導致化療耐藥。NF-κB信號通路作為一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的信號通路,結論亦得到了多項支持。
基于前期研究,本實驗繼續(xù)擬以人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3、人上皮性卵巢癌耐順鉑細胞株SKOV3/DDP為研究對象,初步探討柚皮苷對卵巢癌細胞的作用和相關機制,以及逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的相關信號通路調(diào)節(jié)機制,為臨床逆轉(zhuǎn)卵巢癌化療耐藥提供理論依據(jù)。
第一部分:柚皮苷對卵巢癌細胞增殖的影響及體外逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞的耐藥性<
8、br> 目的:觀察柚皮苷對體外培養(yǎng)的人上皮性卵巢癌細胞株 SKOV3及人上皮性卵巢癌耐順鉑細胞株SKOV3/DDP增殖的影響,觀察柚皮苷體外逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP耐藥性的作用。
方法:1、細胞培養(yǎng):SKOV3及 SKOV3/DDP細胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI l640完全培養(yǎng)基,置于37℃、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng),隔日換液,2~3天傳代一次。
2、MTT法檢測
9、SKOV3及SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性:取對數(shù)生長期細胞,接種于96孔培養(yǎng)板,細胞密度為5×103,實驗組兩種細胞分別加入不同濃度的順鉑(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml),對照組加入不含藥物的RPMI1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h后,MTT法測定各孔的OD值,計算各濃度組的細胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50,并用公示計算SKOV3/DDP細胞的耐藥指數(shù)。
3、MT
10、T法檢測柚皮苷對SKOV3/DDP細胞增殖性的影響:取對數(shù)生長期細胞,常規(guī)胰酶消化后用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100μl(含約5×103個細胞),待細胞貼壁后去培養(yǎng)液并加入不同濃度柚皮苷(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L),每組設5個復孔,分別培養(yǎng)24h、48h、72h,設對照組。根據(jù)測得的吸光度(OD)值,計算不同時間作用下兩組不同濃度細胞的生
11、長抑制率。規(guī)定生長率大于90%的藥物濃度為該藥的非細胞毒性劑量,確定柚皮苷的最佳作用濃度和作用時間。
4、MTT法檢測柚皮苷對SKOV3/DDP細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn):取對數(shù)生長期細胞,接種于96孔培養(yǎng)板,細胞密度為5×103,對照組加入不同濃度的順鉑(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml),每組設5個復孔,實驗組在對照組基礎上加用終濃度為20μmol/L的柚皮苷,培養(yǎng)48h后,計算
12、各組的細胞的增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50、逆轉(zhuǎn)倍數(shù),以判定柚皮苷是否能逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細胞株的耐藥性。
結果:
1、MTT結果顯示:不同濃度的DDP(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml)作用于兩組細胞后,SKOV3細胞的IC50為8.618,SKOV3/DDP的IC50為18.876,耐藥倍數(shù)為2.190,說明SKOV3/DDP是具有DDP耐藥性的耐藥細胞。
13、> 2、MTT結果顯示:不同濃度的柚皮苷均能抑制SKOV3/DDP細胞的增殖,這種抑制作用隨著藥物作用濃度的升高(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)和作用時間的延長(24h、48h、72h)而明顯增加,呈現(xiàn)濃度-時間依賴性;柚皮苷(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)作用于SKOV3/DDP細胞24h后的增殖抑制率為:3.05±0.15%、3.89±0.44%、
14、11.67±0.53%和22.38±0.63%,20μmol/L和10μmol/L組間差異無統(tǒng)計學意義;作用48h后,增殖率分別為4.14±0.21%、7.49±0.62%、28.81±1.22%和36.49±1.14%,不同濃度柚皮苷組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),72h后,不同濃度柚皮苷組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),40μmol/L的柚皮苷48h和72h差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),為避免實驗過程中細胞死亡過多,我
15、們選取柚皮苷20μmol/L作用48h作為研究逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞耐藥性的最適宜濃度和作用時間。
3、隨著DDP濃度的增加,20μmol/L的柚皮苷作用48h后,SKOV3/DDP細胞的增殖抑制率也逐漸增加,分別為8.09±0.47%、17.49±1.30%、25.40±1.10%、41.31±2.34%、71.06±2.12%、83.90±1.15%,實驗組的SKOV3/DDP細胞的IC50為:9.112μg/ml,對
16、照組的IC50為:18.876μg/ml,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);20μmol/L劑量柚皮苷的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為:2.072。
結論:1、不同濃度的柚皮苷單獨或聯(lián)合應用DDP對SKOV3及SKOV3/DDP細胞的體外增殖均有抑制作用,并具有時間-劑量依賴性。
2、非細胞毒性的柚皮苷聯(lián)合DDP可提高其體外抗卵巢癌作用,部分逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞的耐藥性。
第二部分:柚皮苷體外逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP耐藥性
17、的作用機制
目的:探討柚皮苷體外逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞耐藥性的相關分子機制。
方法:1、P-gp在卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP細胞中的表達測定:取對數(shù)生長期細胞,細胞密度為5×103,接種于6孔板,培養(yǎng)48h,提取總蛋白,比較SKOV3及SKOV3/DDP細胞中P-gp蛋白的表達差異。
2、不同濃度柚皮苷對SKOV3/DDP細胞P-gp蛋白的表達影響:不同濃度(10μmol/L、20μmol/L
18、、40μmol/L、80μmol/L)柚皮苷作用于 SKOV3/DDP細胞,培養(yǎng)48h后提取總蛋白,測定 P-gp蛋白的表達情況,了解單用柚皮苷對SKOV3/DDP細胞P-gp蛋白的影響。
3、取對數(shù)生長期細胞,選擇最佳柚皮苷及DDP的作用濃度和時間,作用于SKOV3/DDP細胞,分為單用柚皮苷組(20μmol/L)、單用順鉑組(5μg/ml)、柚皮苷(20μmol/L)聯(lián)合順鉑(5μg/ml)組、設對照組,培養(yǎng)48h后,測定
19、P-gp蛋白的表達,以判定柚皮苷逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的機理;測定cyclinD1、C-myc、caspase3、caspase7、bcl-2、survivin、MMP2、MMP9、VEGF、β-catenin蛋白的表達,以了解柚皮苷通過抑制卵巢癌細胞增殖、誘導凋亡、抑制卵巢癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等機制,從而逆轉(zhuǎn)耐藥的機理。
結果:1、SKOV3和SKOV3/DDP細胞中P-gp蛋白的表達:兩組細胞培養(yǎng)48小時,Western bl
20、otting結果顯示:兩組細胞均有P-gp蛋白的表達,SKOV3細胞的P-gp蛋白的表達量低于SKOV3/DDP細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2、不同濃度柚皮苷(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)作用于SKOV3/DDP細胞,培養(yǎng)48h后,P-gp的蛋白表達量逐漸降低((4.920±0.142、4.750±0.123、3.123±0.146、1.883±0.114),80μmo
21、l/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L柚皮苷組較空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
3、柚皮苷通過下調(diào)P-gp蛋白的表達逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞的耐藥性:單獨柚皮苷組(20μmol/L)、柚皮苷(20μmol/L)聯(lián)合DDP(5μg/ml)組分別與空白對照組比較,P-gp蛋白表達均明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);柚皮苷聯(lián)合DDP組與單獨DDP組比較P-gp蛋白的表達明顯降低,
22、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
4、柚皮苷對SKOV3/DDP細胞凋亡、侵襲相關蛋白的影響:
?、賅estern blotting結果顯示:與空白對照組比較,單獨柚皮苷組、柚皮苷聯(lián)合DDP組的凋亡抑制蛋白bcl-2、survivin的表達均降低,促凋亡蛋白caspase3、caspase7表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);柚皮苷聯(lián)合 DDP組與單獨DDP組比較,bcl-2、survivin表達下降,cas
23、pase3、caspase7表達升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
?、诩毎芷谡{(diào)控蛋白cyclinD1、C-myc在柚皮苷及DDP單藥組、聯(lián)合用藥組中表達降低,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);聯(lián)合用藥組中二者的表達較單用DDP組下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
?、勰[瘤侵襲相關蛋白MMP2、MMP9、VEGF、β-catenin在柚皮苷及單藥組、聯(lián)合用藥組中表達降低,與對照組比較,差異有
24、統(tǒng)計學意義(P<0.05);聯(lián)合用藥組中侵襲相關蛋白的表達較單用DDP組下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結論:柚皮苷作用于SKOV3/DDP細胞,通過下調(diào)P-gp蛋白的表達、下調(diào)凋亡抑制蛋白bcl-2及survivin、上調(diào)促凋亡蛋白caspase3及caspase7表達、下調(diào)細胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1及c-myc、腫瘤侵襲相關蛋白MMP2、MMP9、VEGF、β-catenin的表達等多種機制和途徑,逆轉(zhuǎn)SK
25、OV3/DDP細胞的耐藥性,這可能是柚皮苷逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的部分分子機制。
第三部分:柚皮苷通過調(diào)控NF-κB信號通路逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥的作用機制
目的:探討柚皮苷通過調(diào)控NF-κB信號通路逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥的作用機制。
方法:1、RT-PCR及Western blotting方法檢測不同濃度柚皮苷對實驗室培養(yǎng)的SKOV3/DDP細胞NF-κB基因和蛋白的表達影響。
2
26、、設計合成靶向NF-κB的小干擾RNA(siRNA),靶向沉默NF-κB,構建過表達NF-κB重組質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染細胞,細胞分組如下:空白對照組(不導入質(zhì)粒及siRNA)、空載質(zhì)粒對照組、NF-κB過表達組、siRNA對照組、NF-κB siRNA組。轉(zhuǎn)染NF-κB siRNA及過表達質(zhì)粒48 h后,RT-PCR及Western blotting檢測檢測P-gp的mRNA和蛋白表達水平。
3、轉(zhuǎn)染NF-κB過表達質(zhì)粒的SKOV3
27、/DDP細胞中同時進行柚皮苷干預,分組如下:柚皮苷20μmol/L+NF-κB過表達組、柚皮苷20μmol/L+空載質(zhì)粒對照組。培養(yǎng)48 h后,檢測P-gp的mRNA和蛋白表達水平。
結果:1、RT-PCR及Westem blotting結果均顯示,隨著柚皮苷濃度增大, NF-κB的mRNA和蛋白表達逐漸下降,與空白對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L與10μmol
28、/L柚皮苷組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);但40μmol/L和20μmol/L組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
2、RT-PCR及Westem blotting結果顯示,NF-κB過表達組P-gp的mRNA及蛋白表達升高,而siNF-κB組P-gp的mRNA及蛋白量表達降低,與空白對照組、空載質(zhì)粒及siRNA對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
3、實驗組轉(zhuǎn)染過表達NF-κB質(zhì)粒,對照組轉(zhuǎn)
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