柚皮苷對人卵巢癌耐藥細胞SKOV3-DDP的體外逆轉(zhuǎn)作用及其機制.pdf

1、卵巢癌(Ovarian cancer, OC)是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而高居第三位。但因其缺乏早期特異性癥狀以及有效的篩查手段，70％的病人在首次就診時已是晚期，治療難度大、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移快，是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤死亡率最高的腫瘤。手術(shù)治療和以紫杉醇、順鉑等為主的聯(lián)合化療方案一定程度上改善了患者的預(yù)后，但治療過程中產(chǎn)生的化療耐藥令卵巢癌的5年生存率始終徘徊在30-40%左右，是婦科腫瘤醫(yī)生和研究人

2、員面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。
　　腫瘤的多藥耐藥（Multi-drug resistance, MDR）是指腫瘤細胞在接觸一種抗腫瘤藥產(chǎn)生耐藥性后，對未接觸過的、結(jié)構(gòu)不同、作用機制各異的其他抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。腫瘤的多藥耐藥機制產(chǎn)生復(fù)雜，一個重要原因就是轉(zhuǎn)運體 P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）細胞內(nèi)藥物外排。P-gp利用細胞內(nèi)的三磷酸腺苷（ATP）將多種細胞毒性藥物排出細胞外，增加了腫瘤細胞對藥物的抵抗性，從而使腫

3、瘤細胞耐藥。多年來，圍繞MDR1/P-gp為靶標的逆轉(zhuǎn)耐藥研究，包括使用P-gp的競爭性抑制劑、單克隆抗體、反義寡核苷酸技術(shù)、RNA干擾技術(shù)等開始嶄露頭角，但多藥耐藥的形成是一個多基因、多因素的復(fù)雜的過程，靶向治療涉及的非特異性、副作用、安全、經(jīng)濟等問題限制了其應(yīng)用。因此探索新的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的途徑、逆轉(zhuǎn)耐藥成為卵巢癌治療的熱點和難點。
　　我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥博大精深，近年來，從傳統(tǒng)中藥及天然植物中提取的多種抗腫瘤成分已被證實為有效

4、的抗腫瘤制劑。柚皮苷（Naringin）全稱為柚皮素新橙皮糖苷，是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于蕓香科植物，如柚子、葡萄柚、酸橙及其變種的果皮中，具有資源豐富、化學(xué)結(jié)構(gòu)清晰、原材料價格低廉的優(yōu)勢?，F(xiàn)有研究表明，柚皮苷具有抗癌、抗炎、預(yù)防動脈粥樣硬化等藥理作用。與其他黃酮類化合物一樣，柚皮苷也具有抗腫瘤作用，對常見的腫瘤如乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌及肝癌等均具有有效的抗癌作用，在婦科惡性腫瘤中的研究尚少見。本課題組的前期結(jié)果提示：柚皮苷能明

5、顯抑制人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3細胞體外增殖，且隨著藥物作用時間的延長和濃度增大，柚皮苷對卵巢癌增殖抑制率逐漸增大。進一步研究顯示：柚皮苷對人上皮性卵巢癌耐順鉑（DDP）細胞株SKOV3/DDP細胞的體外增殖亦具有明顯抑制作用，并能增強SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性，其逆轉(zhuǎn)耐藥的機制可能與下調(diào)多藥耐藥基因MDR1及多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP2基因的表達有關(guān)，為證實柚皮苷在卵巢癌抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性的作用提供了初步的思路。

6、　　近年來研究顯示，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κappaB NF-κB）與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移均有密切的關(guān)系，它所編碼的許多蛋白能促進腫瘤生長；順鉑耐藥卵巢癌細胞中NF-κB持續(xù)高表達，且其在卵巢癌細胞耐藥機制中處于核心地位；NF-κB通過調(diào)節(jié)下游靶蛋白Bcl-xL、Bcl-2、Fas/FasL、XIAP、survivin、cIAP1/2、CDK2、VEGF、COX-2等發(fā)揮抗凋亡作用，令腫瘤細胞生存能力增強，最

7、終導(dǎo)致化療耐藥。NF-κB信號通路作為一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路，結(jié)論亦得到了多項支持。
　　基于前期研究，本實驗繼續(xù)擬以人上皮性卵巢癌細胞株SKOV3、人上皮性卵巢癌耐順鉑細胞株SKOV3/DDP為研究對象，初步探討柚皮苷對卵巢癌細胞的作用和相關(guān)機制，以及逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)機制，為臨床逆轉(zhuǎn)卵巢癌化療耐藥提供理論依據(jù)。
　　第一部分：柚皮苷對卵巢癌細胞增殖的影響及體外逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞的耐藥性<

8、br>　　目的：觀察柚皮苷對體外培養(yǎng)的人上皮性卵巢癌細胞株 SKOV3及人上皮性卵巢癌耐順鉑細胞株SKOV3/DDP增殖的影響，觀察柚皮苷體外逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP耐藥性的作用。
　　方法：1、細胞培養(yǎng)：SKOV3及 SKOV3/DDP細胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI l640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，隔日換液，2~3天傳代一次。
　　2、MTT法檢測

9、SKOV3及SKOV3/DDP細胞對順鉑的敏感性：取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，細胞密度為5×103，實驗組兩種細胞分別加入不同濃度的順鉑（1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml），對照組加入不含藥物的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，MTT法測定各孔的OD值，計算各濃度組的細胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50，并用公示計算SKOV3/DDP細胞的耐藥指數(shù)。
　　3、MT

10、T法檢測柚皮苷對SKOV3/DDP細胞增殖性的影響：取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)胰酶消化后用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl（含約5×103個細胞），待細胞貼壁后去培養(yǎng)液并加入不同濃度柚皮苷（10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L），每組設(shè)5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h，設(shè)對照組。根據(jù)測得的吸光度（OD）值，計算不同時間作用下兩組不同濃度細胞的生

11、長抑制率。規(guī)定生長率大于90%的藥物濃度為該藥的非細胞毒性劑量，確定柚皮苷的最佳作用濃度和作用時間。
　　4、MTT法檢測柚皮苷對SKOV3/DDP細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)：取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，細胞密度為5×103，對照組加入不同濃度的順鉑（1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml），每組設(shè)5個復(fù)孔，實驗組在對照組基礎(chǔ)上加用終濃度為20μmol/L的柚皮苷，培養(yǎng)48h后，計算

12、各組的細胞的增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，以判定柚皮苷是否能逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細胞株的耐藥性。
　　結(jié)果：
　　1、MTT結(jié)果顯示：不同濃度的DDP（1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml）作用于兩組細胞后，SKOV3細胞的IC50為8.618，SKOV3/DDP的IC50為18.876，耐藥倍數(shù)為2.190，說明SKOV3/DDP是具有DDP耐藥性的耐藥細胞。

13、>　　2、MTT結(jié)果顯示：不同濃度的柚皮苷均能抑制SKOV3/DDP細胞的增殖，這種抑制作用隨著藥物作用濃度的升高（10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）和作用時間的延長（24h、48h、72h）而明顯增加，呈現(xiàn)濃度-時間依賴性；柚皮苷（10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）作用于SKOV3/DDP細胞24h后的增殖抑制率為：3.05±0.15%、3.89±0.44%、

14、11.67±0.53%和22.38±0.63%，20μmol/L和10μmol/L組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；作用48h后，增殖率分別為4.14±0.21%、7.49±0.62%、28.81±1.22%和36.49±1.14%，不同濃度柚皮苷組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），72h后，不同濃度柚皮苷組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），40μmol/L的柚皮苷48h和72h差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），為避免實驗過程中細胞死亡過多，我

15、們選取柚皮苷20μmol/L作用48h作為研究逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞耐藥性的最適宜濃度和作用時間。
　　3、隨著DDP濃度的增加，20μmol/L的柚皮苷作用48h后，SKOV3/DDP細胞的增殖抑制率也逐漸增加，分別為8.09±0.47%、17.49±1.30%、25.40±1.10%、41.31±2.34%、71.06±2.12%、83.90±1.15%，實驗組的SKOV3/DDP細胞的IC50為：9.112μg/ml，對

16、照組的IC50為：18.876μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；20μmol/L劑量柚皮苷的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為：2.072。
　　結(jié)論：1、不同濃度的柚皮苷單獨或聯(lián)合應(yīng)用DDP對SKOV3及SKOV3/DDP細胞的體外增殖均有抑制作用，并具有時間-劑量依賴性。
　　2、非細胞毒性的柚皮苷聯(lián)合DDP可提高其體外抗卵巢癌作用，部分逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞的耐藥性。
　　第二部分：柚皮苷體外逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP耐藥性

17、的作用機制
　　目的：探討柚皮苷體外逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞耐藥性的相關(guān)分子機制。
　　方法：1、P-gp在卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP細胞中的表達測定：取對數(shù)生長期細胞，細胞密度為5×103，接種于6孔板，培養(yǎng)48h，提取總蛋白，比較SKOV3及SKOV3/DDP細胞中P-gp蛋白的表達差異。
　　2、不同濃度柚皮苷對SKOV3/DDP細胞P-gp蛋白的表達影響：不同濃度（10μmol/L、20μmol/L

18、、40μmol/L、80μmol/L）柚皮苷作用于 SKOV3/DDP細胞，培養(yǎng)48h后提取總蛋白，測定 P-gp蛋白的表達情況，了解單用柚皮苷對SKOV3/DDP細胞P-gp蛋白的影響。
　　3、取對數(shù)生長期細胞，選擇最佳柚皮苷及DDP的作用濃度和時間，作用于SKOV3/DDP細胞，分為單用柚皮苷組（20μmol/L）、單用順鉑組（5μg/ml）、柚皮苷（20μmol/L）聯(lián)合順鉑（5μg/ml）組、設(shè)對照組，培養(yǎng)48h后，測定

19、P-gp蛋白的表達，以判定柚皮苷逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的機理；測定cyclinD1、C-myc、caspase3、caspase7、bcl-2、survivin、MMP2、MMP9、VEGF、β-catenin蛋白的表達，以了解柚皮苷通過抑制卵巢癌細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制卵巢癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等機制，從而逆轉(zhuǎn)耐藥的機理。
　　結(jié)果：1、SKOV3和SKOV3/DDP細胞中P-gp蛋白的表達：兩組細胞培養(yǎng)48小時，Western bl

20、otting結(jié)果顯示：兩組細胞均有P-gp蛋白的表達，SKOV3細胞的P-gp蛋白的表達量低于SKOV3/DDP細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2、不同濃度柚皮苷（10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）作用于SKOV3/DDP細胞，培養(yǎng)48h后，P-gp的蛋白表達量逐漸降低（（4.920±0.142、4.750±0.123、3.123±0.146、1.883±0.114），80μmo

21、l/L、40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L柚皮苷組較空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、柚皮苷通過下調(diào)P-gp蛋白的表達逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞的耐藥性：單獨柚皮苷組（20μmol/L）、柚皮苷（20μmol/L）聯(lián)合DDP（5μg/ml）組分別與空白對照組比較，P-gp蛋白表達均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；柚皮苷聯(lián)合DDP組與單獨DDP組比較P-gp蛋白的表達明顯降低，

22、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　4、柚皮苷對SKOV3/DDP細胞凋亡、侵襲相關(guān)蛋白的影響：
　?、賅estern blotting結(jié)果顯示：與空白對照組比較，單獨柚皮苷組、柚皮苷聯(lián)合DDP組的凋亡抑制蛋白bcl-2、survivin的表達均降低，促凋亡蛋白caspase3、caspase7表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；柚皮苷聯(lián)合 DDP組與單獨DDP組比較，bcl-2、survivin表達下降，cas

23、pase3、caspase7表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　?、诩毎芷谡{(diào)控蛋白cyclinD1、C-myc在柚皮苷及DDP單藥組、聯(lián)合用藥組中表達降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；聯(lián)合用藥組中二者的表達較單用DDP組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　?、勰[瘤侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9、VEGF、β-catenin在柚皮苷及單藥組、聯(lián)合用藥組中表達降低，與對照組比較，差異有

24、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；聯(lián)合用藥組中侵襲相關(guān)蛋白的表達較單用DDP組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論：柚皮苷作用于SKOV3/DDP細胞，通過下調(diào)P-gp蛋白的表達、下調(diào)凋亡抑制蛋白bcl-2及survivin、上調(diào)促凋亡蛋白caspase3及caspase7表達、下調(diào)細胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1及c-myc、腫瘤侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9、VEGF、β-catenin的表達等多種機制和途徑，逆轉(zhuǎn)SK

25、OV3/DDP細胞的耐藥性，這可能是柚皮苷逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的部分分子機制。
　　第三部分：柚皮苷通過調(diào)控NF-κB信號通路逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥的作用機制
　　目的：探討柚皮苷通過調(diào)控NF-κB信號通路逆轉(zhuǎn)SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥的作用機制。
　　方法：1、RT-PCR及Western blotting方法檢測不同濃度柚皮苷對實驗室培養(yǎng)的SKOV3/DDP細胞NF-κB基因和蛋白的表達影響。
　　2

26、、設(shè)計合成靶向NF-κB的小干擾RNA（siRNA），靶向沉默NF-κB，構(gòu)建過表達NF-κB重組質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染細胞，細胞分組如下：空白對照組（不導(dǎo)入質(zhì)粒及siRNA）、空載質(zhì)粒對照組、NF-κB過表達組、siRNA對照組、NF-κB siRNA組。轉(zhuǎn)染NF-κB siRNA及過表達質(zhì)粒48 h后，RT-PCR及Western blotting檢測檢測P-gp的mRNA和蛋白表達水平。
　　3、轉(zhuǎn)染NF-κB過表達質(zhì)粒的SKOV3

27、/DDP細胞中同時進行柚皮苷干預(yù)，分組如下：柚皮苷20μmol/L+NF-κB過表達組、柚皮苷20μmol/L+空載質(zhì)粒對照組。培養(yǎng)48 h后，檢測P-gp的mRNA和蛋白表達水平。
　　結(jié)果：1、RT-PCR及Westem blotting結(jié)果均顯示，隨著柚皮苷濃度增大， NF-κB的mRNA和蛋白表達逐漸下降，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；80μmol/L、40μmol/L、20μmol/L與10μmol

28、/L柚皮苷組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；但40μmol/L和20μmol/L組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　2、RT-PCR及Westem blotting結(jié)果顯示，NF-κB過表達組P-gp的mRNA及蛋白表達升高，而siNF-κB組P-gp的mRNA及蛋白量表達降低，與空白對照組、空載質(zhì)粒及siRNA對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、實驗組轉(zhuǎn)染過表達NF-κB質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)