補(bǔ)腎法、疏肝法改善超促排卵小鼠子宮內(nèi)膜容受性與調(diào)控MAPK家族信號(hào)通路的關(guān)系.pdf

1、目的：本研究通過(guò)觀察補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)超促排卵小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜VEGFR-2及其下游血管生成MAPK家族信號(hào)通路的影響，以探討兩種方法改善子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制和環(huán)節(jié)之異同。
　　方法：將240只動(dòng)情周期正常的雌性小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、補(bǔ)腎組、疏肝組，每組各60只。除正常組外，各組建立控制性超促排卵小鼠模型。補(bǔ)腎組、疏肝組分別從造模第1天開(kāi)始灌胃補(bǔ)腎助孕方混懸液和逍遙丸混懸液。模型組和正常組給予同等劑量蒸餾水灌胃，連續(xù)1

2、1天。正常組于動(dòng)情期，模型組、補(bǔ)腎組、疏肝組于注射HCG日，按雌:雄=2:1比例合籠飼養(yǎng)。次日晨見(jiàn)陰栓記為孕1d，各組孕鼠分別于孕2d、3d、4d、5d、6d取材，通過(guò)放射免疫法檢測(cè)小鼠血清中雌二醇（E2）、孕酮（P）含量；采用HE染色觀察小鼠子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)學(xué)變化；掃描電鏡觀察小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突的形態(tài)，免疫組化法檢測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、微血管密度（MVD）、VEGF、VEGFR-2、PCNA、Cycl

3、inD1、MMP-9蛋白表達(dá)，Western Blot法檢測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜ER、PR、PCNA、CyclinD1、MMP-9、VEGF、VEGFR-2及其下游血管生成相關(guān)分子蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9mRNA表達(dá)；統(tǒng)計(jì)比較各組小鼠陰栓率、妊娠率及胚胎著床數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.各組小鼠陰栓率、妊娠率及胚胎著床數(shù):與正常組比較，模型組小鼠陰栓率、妊娠率均下降

4、，胚胎著床數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，補(bǔ)腎組、疏肝組陰栓率、妊娠率均提高，且胚胎著床數(shù)增加；補(bǔ)腎組陰栓率、妊娠率及胚胎著床數(shù)較疏肝組增加，但兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.圍著床期各組小鼠雌孕激素及其受體水平比較:各組小鼠隨著妊娠天數(shù)的增加，血清E2、P值逐漸升高。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠血清E2值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，補(bǔ)腎組、疏肝組血清E2值升高。孕第3、5天補(bǔ)腎組血清E2值

5、高于疏肝組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各天兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠血清P值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，補(bǔ)腎組、疏肝組血清P值升高；補(bǔ)腎組與疏肝組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ER、PR蛋白表達(dá)主要定位于小鼠子宮內(nèi)膜腺體、間質(zhì)的胞漿中。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組ER、PR蛋白表達(dá)降低；與模型組比較，補(bǔ)腎組、疏肝組ER、PR蛋白表達(dá)升高；補(bǔ)腎組與疏肝組之間比較表達(dá)無(wú)明顯差異。

6、
　　3.圍著床期各組小鼠子宮內(nèi)膜厚度比較:各組小鼠隨著妊娠天數(shù)的增加，子宮內(nèi)膜逐漸增厚。與正常組比較，模型組小鼠孕第2、3、4、5、6天子宮內(nèi)膜厚度均明顯降低；與模型組比較，補(bǔ)腎組、疏肝組孕第2、3、4、5、6天子宮內(nèi)膜厚度均顯著增加；補(bǔ)腎組與疏肝組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.圍著床期各組小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化。HE染色顯示：正常組：小鼠隨著妊娠天數(shù)的增加，子宮內(nèi)膜逐漸增厚；腺體數(shù)量增多，腺腔變大、彎曲，腺腔分泌物增

7、多；間質(zhì)疏松水腫，基質(zhì)細(xì)胞增大，在孕第4天后宮腔逐漸閉合，基質(zhì)細(xì)胞增殖分化成蛻膜細(xì)胞。模型組：與正常組比較，子宮內(nèi)膜較薄且發(fā)育不良，腺體少而小，腺腔擴(kuò)張不明顯，腺腔分泌物較少；間質(zhì)疏松水腫，相對(duì)致密，部分小鼠子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)腺體與間質(zhì)發(fā)育不同步，間質(zhì)呈分泌期改變而腺體發(fā)育仍為增生期。補(bǔ)腎組、疏肝組內(nèi)膜發(fā)育與正常組接近，優(yōu)于模型組，兩組間比較無(wú)明顯差異。
　　5.圍著床期各組小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突的變化。胞飲突主要分布于子宮內(nèi)膜腺體開(kāi)口處。

8、正常組：孕第3天，部分子宮內(nèi)膜細(xì)胞表面形成一些膜狀突起，突起表面有微絨毛覆蓋，絨毛短，稀疏，為發(fā)育中的胞飲突；孕第4天子宮內(nèi)膜表面有大量均勻分布、邊界清楚的膜狀突起，表面光滑，無(wú)微絨毛覆蓋，為完全發(fā)育的胞飲突；孕第5天胞飲突表面皺縮，凹陷，微絨毛重新出現(xiàn)，為退化的胞飲突。模型組：孕第3天，胞飲突凸起較正常組明顯，微絨毛較短較稀疏，發(fā)育較正常組提前；孕第4天，子宮內(nèi)膜胞飲突數(shù)量較正常組減少，表面皺縮，大小不一，整體發(fā)育不同步，未見(jiàn)完全發(fā)育

9、的胞飲突，提示胞飲突發(fā)育提前；孕第5天胞飲突皺縮較正常組明顯，微絨毛較少。補(bǔ)腎組、疏肝組：孕第3天，膜狀突起出現(xiàn)，表面覆有微絨毛；孕第4天為完全發(fā)育的胞飲突，較模型組表面相對(duì)飽滿(mǎn)、分布相對(duì)均勻；孕第5天胞飲突發(fā)育與正常組接近，為退化的胞飲突。
　　6.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MVD在不同分組之間的比較:CD34為血管密度標(biāo)志物，表達(dá)于子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，用于測(cè)定MVD。孕第2、3、4、5、6天：與正常組相比，模型組MVD明顯下降；與模

10、型組比較，補(bǔ)腎組、疏肝組MVD顯著增加；與正常組比較，補(bǔ)腎組、疏肝組MVD降低。孕第6天，補(bǔ)腎組MVD高于疏肝組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白定位。VEGF、VEGFR-2蛋白在圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)在空間上高度一致，主要定位在子宮內(nèi)膜腔上皮、腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中；PCNA蛋白表達(dá)主要定位在子宮內(nèi)膜腔上皮、間質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)，

11、腺上皮細(xì)胞核有少量表達(dá)；CyclinD1主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腔上皮、腺上皮的細(xì)胞核中，間質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)較弱；MMP-9在子宮內(nèi)膜的腔上皮、腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞漿中均有表達(dá)。
　　8.VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白及其mRNA時(shí)序表達(dá)規(guī)律。孕第2天VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白及其mRNA表達(dá)較低，之后逐漸上升，于孕第4天達(dá)到峰值，與其他時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、，之后表達(dá)逐漸下降。
　　9.VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白及其mRNA表達(dá)結(jié)果在不同分組之間的比較。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜VEGF和VEGFR-2蛋白及其mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，補(bǔ)腎組、疏肝組VEGF、VEGFR-2蛋白及其mRNA表達(dá)明顯升高。但與正常組比較，孕第2、4、5、6天，補(bǔ)腎組、疏肝組VEGF蛋白及其mRNA表達(dá)降低，

13、孕第3、4、5、6天補(bǔ)腎組、疏肝組VEGFR-2蛋白及其mRNA表達(dá)降低。孕第6天補(bǔ)腎組VEGF、VEGFR-2蛋白及其mRNA表達(dá)高于疏肝組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各天補(bǔ)腎組與疏肝組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜PCNA蛋白及其mRNA表達(dá)低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，補(bǔ)腎組、疏肝組PCNA蛋白及其mRNA表達(dá)明顯增多。孕第2、3、6天，補(bǔ)腎組與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，孕第4

14、、5天補(bǔ)腎組低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。孕第2、3、4、5天補(bǔ)腎組PCNA蛋白及其mRNA表達(dá)均高于疏肝組。孕第2、3、4、5、6天：與正常組相比，模型組小鼠子宮內(nèi)膜CyclinD1蛋白及其mRNA表達(dá)明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，補(bǔ)腎組、疏肝組CyclinD1蛋白及其mRNA表達(dá)明顯升高；補(bǔ)腎組、疏肝組低于正常組，兩組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)膜MMP-9蛋白及其m

15、RNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，補(bǔ)腎組、疏肝組MMP-9蛋白及其mRNA表達(dá)明顯升高。孕第2、3、4、5天補(bǔ)腎組低于正常組，孕第2、4天疏肝組低于正常組，孕第2、3、4、5天疏肝組高于補(bǔ)腎組。孕第6天，補(bǔ)腎組、疏肝組、正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　10.Western Blot法檢測(cè)VEGFR-2下游MAPK家族信號(hào)通路蛋白表達(dá)。孕2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白表達(dá)

16、降低；與模型組比較，補(bǔ)腎組p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白表達(dá)升高；疏肝組p-P38、p-JNK蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，疏肝組p-ERK表達(dá)增強(qiáng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；疏肝組p-ERK蛋白表達(dá)較補(bǔ)腎組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.VEGF參與胚泡著床且在圍著床期表達(dá)具有時(shí)空特異性，可作為子宮內(nèi)膜容受性評(píng)價(jià)指標(biāo)。
　　2.控制性超促排卵降低圍著床期小鼠血清E2、P水平，影響ER、PR表達(dá)，使子

17、宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)發(fā)育不同步，胞飲突發(fā)育提前，下調(diào)VEGF及其受體，降低微血管密度，影響VEGFR-2下游MAPK家族3條信號(hào)通路，降低通路活性，減少磷酸化ERK、P38、JNK的表達(dá)，下調(diào)通路下游目的基因PCNA、CycinD1、MMP-9的表達(dá)，影響子宮內(nèi)膜血管生成，降低子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致妊娠率、著床率降低。
　　3.補(bǔ)腎法、疏肝法通過(guò)改善超促排卵小鼠血清E2、P水平及ER、PR表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜形態(tài)及胞飲突發(fā)育，上調(diào)VEGF

18、及其受體，改善微血管密度，調(diào)控VEGFR-2下游MAPK家族3條信號(hào)通路，增加通路活性，提高磷酸化ERK、P38、JNK的表達(dá)，促進(jìn)通路下游目的基因PCNA、CycinD1、MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移，有利于子宮內(nèi)膜血管生成，改善子宮內(nèi)膜容受性，從而提高小鼠妊娠率和著床率。
　　4.補(bǔ)腎法促進(jìn)磷酸化ERK表達(dá)優(yōu)于疏肝法；補(bǔ)腎法在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，加速血管生成，改善子宮內(nèi)膜容受性方面優(yōu)于疏肝法；疏肝法在水解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM