補(bǔ)腎法、疏肝法對小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響與調(diào)控OSFs及其Smads通路關(guān)系的比較研究.pdf

1、不孕不育癥是嚴(yán)重影響人類生殖健康的世界性問題，在我國的發(fā)病率約為7％-10％，隨著人類輔助生殖技術(shù)(assistedreproductivetechnology，ART)的快速發(fā)展，體外受精-胚胎移植(Invitrofertilization-embryotransfer，IVF-ET)技術(shù)在卵泡的募集和卵母細(xì)胞的獲取上已經(jīng)有90％以上的成功機(jī)會，胚胎質(zhì)量明顯優(yōu)化，獲取優(yōu)質(zhì)胚胎的數(shù)量亦明顯增多，但是其臨床妊娠率卻一直未能盡如人意，且多胎

2、妊娠發(fā)生率和流產(chǎn)率較高，如何更好的提高IVF-ET過程卵細(xì)胞的數(shù)量及質(zhì)量成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來，中醫(yī)藥在提高卵母細(xì)胞質(zhì)量、誘導(dǎo)排卵、提高妊娠率及降低西藥的毒副作用等方面取得了長足的發(fā)展。本課題組前期研究了補(bǔ)腎法、疏肝法對無排卵模型大鼠生殖功能的影響，證實(shí)補(bǔ)腎法、疏肝法可以通過改善腺垂體、卵巢形態(tài)，調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)水平以及生殖內(nèi)分泌激素水平，促進(jìn)卵泡發(fā)育和成熟，并可促進(jìn)子宮發(fā)育，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜環(huán)境以有利于孕卵著床;研究了補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方

3、、逍遙散對IVF-ET妊娠結(jié)局及OSFs的影響，證實(shí)加用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散可以增加獲卵數(shù)，提高優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床妊娠率。本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過動物實(shí)驗(yàn)研究補(bǔ)腎法、疏肝法對卵母細(xì)胞發(fā)育的影響，為在臨床上聯(lián)合IVF-ET治療不孕癥奠定理論基礎(chǔ)。
　　 卵母細(xì)胞的數(shù)量及質(zhì)量直接影響到IVF-ET的結(jié)局，近些年對生殖生理及生殖內(nèi)分泌的研究發(fā)現(xiàn)，卵泡發(fā)育除了受下丘腦、垂體分泌的相關(guān)激素水平調(diào)控外，卵母細(xì)胞分泌因子(Oocyt

4、esecretedfactors，OSFs)在調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和衰退，影響優(yōu)勢卵泡的選擇以及閉鎖卵泡的形成方面發(fā)揮重要作用，其中，卵母細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)超家族成員GDF-9與BMP-6通過與Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，與Ⅰ型受體共同作用啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]，而Smads是TGF-β超家族下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的作用。GDF-9和BMP-6及其S

5、mads信號途徑對體內(nèi)卵泡發(fā)生發(fā)育、卵丘擴(kuò)散、卵母細(xì)胞的成熟至關(guān)重要[2-3]。由于在臨床上收集人卵母細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究的局限性，本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，以小鼠卵母細(xì)胞OSFs及其Smads通路為切入點(diǎn)研究補(bǔ)腎法、疏肝法對小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響與調(diào)控OSFs及其Smads通路關(guān)系，探討補(bǔ)腎法、疏肝法提高卵母細(xì)胞質(zhì)量、改善妊娠結(jié)局的機(jī)制和作用環(huán)節(jié)，為中醫(yī)藥輔助IVF-ET治療不孕癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分補(bǔ)腎法、疏肝法對小

6、鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量及妊娠結(jié)局的影響
　　 目的:觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸對小鼠卵母細(xì)胞數(shù)量、優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)、妊娠率、子宮胚胎數(shù)及相關(guān)激素水平的影響，以探討補(bǔ)腎法、疏肝法對小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量及妊娠結(jié)局的影響。
　　 方法:選用6-7周齡健康雌性昆明小鼠210只，8-9周齡有生育能力雄性小鼠120只，將雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)分為6組，即補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組、控制性超排卵組（COH組）和空白對照組

7、，每組35只。補(bǔ)腎高、低劑量組分別給予補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方口服液5.4g/ml、2.7g/ml，疏肝高、低劑量組分別給予逍遙丸混懸液0.6g/ml、0.3g/ml，COH組和空白對照組用蒸餾水灌胃。每日8:00各組小鼠均以1ml/100g體重灌胃，連續(xù)10天。治療組及COH組于第11日同時腹腔注射PMSG10IU/只，48h后腹腔注射HCG10IU，空白對照組每日陰道涂片，觀察動情周期。注射HCG同時，補(bǔ)腎高低劑量組、疏肝高低劑量組和COH組各取

8、20只;空白對照組陰道涂片見到大量角化上皮細(xì)胞時取20只，按雌∶雄=1∶1比例分別合籠飼養(yǎng)，次日早晨7:00-8:00檢查雌鼠陰道，發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠第1天（陰栓為小鼠陰道分泌物與精液凝結(jié)而成），于妊娠第18-20天解剖雌鼠，觀察妊娠鼠數(shù)及子宮胚胎數(shù)?？瞻讓φ战M剩余15只小鼠于陰道涂片見到大量角化上皮細(xì)胞的次日、其余各組剩余小鼠于注射HCG16h后，用摘除眼球法取血，留取血清后測定FSH、LH、E2的含量;然后脫頸椎處死小鼠，留取卵母細(xì)

9、胞，計(jì)數(shù)卵泡數(shù)量及優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)。
　　 結(jié)果:(1)各組小鼠獲卵數(shù)及優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)比較:與空白對照組比較，COH組及各治療組獲卵數(shù)增加(P＜0.05)，各治療組與COH組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各治療組之間獲卵數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);各治療組優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)高于空白對照組及COH組(P＜0.05)，COH組低于空白對照組(P＜0.05);高劑量組優(yōu)質(zhì)卵泡數(shù)均優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，補(bǔ)腎高劑量組與疏肝高劑量組的優(yōu)

10、質(zhì)卵泡數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，補(bǔ)腎低劑量組與疏肝低劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)各組小鼠妊娠率及子宮胚胎數(shù)比較:COH組小鼠妊娠率較空白對照組降低(P＜0.05)，補(bǔ)腎高劑量組和疏肝高劑量組妊娠率較空白對照組及COH組升高(P＜0.05)，低劑量組與空白對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);高劑量組小鼠妊娠率均優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，高劑量組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，低劑量組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(P＞0.05);各組之間子宮胚胎數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(3)各組小鼠血清FSH、LH、E2值比較:與空白對照組比較，各治療組及COH組血清FSH、LH、E2水平增高(P＜0.05);與COH組比較，各治療組血清FSH、LH、E2水平增高（P＜0.05），其中高劑量組的表達(dá)優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，補(bǔ)腎高劑量組與疏肝高劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，補(bǔ)腎低劑量組與疏肝低劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

12、。
　　 結(jié)論:在用促性腺激素處理小鼠的同時加用補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸不會降低獲卵數(shù)，并能增加優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞數(shù)量，提高妊娠率及總胚胎數(shù)。
　　 第二部分:補(bǔ)腎法、疏肝法對小鼠卵母細(xì)胞GDF-9及Smads通路影響的比較
　　 目的:通過研究補(bǔ)腎法、疏肝法對小鼠卵母細(xì)胞中卵母細(xì)胞分泌因子GDF-9、相關(guān)受體BMPRⅡ、ALK-5及下游Smads通路中Smad2、Smad3的影響，探討兩法對卵母細(xì)胞質(zhì)量影響的靶向性機(jī)制。<

13、br>　　 方法:選用6-7周齡健康雌性昆明小鼠600只，按隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)化分為6組，即補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組、COH組和空白對照組，每組100只。補(bǔ)腎高、低劑量組分別給予補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方口服液，疏肝高、低劑量組分別給予逍遙丸混懸液，COH組和空白對照組用蒸餾水灌胃。每日8:00各組小鼠均以1ml/100g體重灌胃，連續(xù)10天。補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、疏肝高劑量組、疏肝低劑量組及COH組于第11日同

14、時腹腔注射PMSG10IU/只，48h后腹腔注射HCG10IU/只;空白對照組每日陰道涂片，觀察動情周期。注射HCG16h后，取補(bǔ)腎高低劑量組、疏肝高低劑量組和COH組小鼠，以及空白對照組陰道涂片見到大量角化上皮細(xì)胞的次日小鼠，脫頸椎處死，在體視鏡下用1ml注射針劃破輸卵管壺腹部，收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，用透明質(zhì)酸酶消化掉卵丘顆粒細(xì)胞后用PBS反復(fù)沖洗，獲得MⅡ期卵母細(xì)胞，采用免疫組化法、實(shí)時熒光定量PCR分別檢測卵母細(xì)胞中

15、GDF-9、ALK-5、BMPRⅡ、Smad2、Smad3蛋白及其mRNA表達(dá);采用Westernblot方法檢測卵母細(xì)胞中GDF-9和BMPRⅡ蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:(1)與空白對照組比較，COH組GDF-9蛋白及mRNA的表達(dá)降低(P＜0.05)，各治療組的表達(dá)升高（P＜0.05）;高劑量組GDF-9蛋白及mRNA表達(dá)高于低劑量組(P＜0.05)，補(bǔ)腎高劑量組與疏肝高劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，補(bǔ)腎低劑量組與

16、疏肝低劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)與空白對照組比較，COH組、補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組及疏肝低劑量組BMPRⅡ蛋白及mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);疏肝高劑量組BMPRⅡ蛋白和mRNA的表達(dá)較其余各組均增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)ALK-5、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)在各組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方和逍遙丸均可以提高小鼠卵母細(xì)胞GDF-9蛋白及m

17、RNA的表達(dá)，從而改善卵泡發(fā)育，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，但其機(jī)制與GDF-9Ⅰ型受體及下游Smads通路無關(guān)。
　　 第三部分:補(bǔ)腎法、疏肝法對小鼠卵母細(xì)胞BMP-6及Smads通路影響的比較
　　 目的:通過觀察補(bǔ)腎法、疏肝法對小鼠卵母細(xì)胞中卵母細(xì)胞分泌因子BMP-6、相關(guān)受體ALK-2、ALK-6及下游Smads通路中Smad1、Smad5、Smad8和Smad4的影響，探討兩法對卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響的靶向性機(jī)制。
　

18、　 方法:動物分組及取材同第二部分。免疫組化和Westernblot方法檢測卵母細(xì)胞BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8、Smad4蛋白的表達(dá)，實(shí)時熒光定量PCR法檢測卵母細(xì)胞上述指標(biāo)mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:(1)BMP-6:與空白對照組比較，COH組卵母細(xì)胞BMP-6蛋白和mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各治療組表達(dá)升高，并高于COH組(P＜0.05);疏肝高劑量組的表達(dá)高

19、于補(bǔ)腎低劑量組和疏肝低劑量組(P＜0.05)，低于補(bǔ)腎高劑量組(P＜0.05);補(bǔ)腎低劑量組與疏肝低劑量組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)ALK-2:與空白對照組比較，COH組ALK-2蛋白及mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);各治療組ALK-2的蛋白及mRNA表達(dá)均高于空白對照組和COH組(P＜0.05);組間比較顯示:各治療組高劑量組ALK-2蛋白及mRNA表達(dá)均高于低劑量組(P＜0.05);疏肝高劑量組表達(dá)較補(bǔ)腎

20、高劑量組降低(P＜0.05)，補(bǔ)腎低劑量組與疏肝低劑量組比較則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(3)ALK-6:與空白對照組比較，COH組ALK-6蛋白及mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);空白對照組和COH組與治療組比較，ALK-6蛋白及mRNA表達(dá)降低(P＜0.05);補(bǔ)腎組表達(dá)高于疏肝組(P＜0.05)，補(bǔ)腎低劑量組的ALK-6蛋白及mRNA表達(dá)較補(bǔ)腎高劑量組降低(P＜0.05)，疏肝高劑量組蛋白表達(dá)高于疏肝低劑量組(P＜0.

21、05)。(4)Smad1:空白對照組與COH組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);各治療組Smad1蛋白及mRNA表達(dá)高于空白對照組和COH組(P＜0.05);與補(bǔ)腎高劑量組比較，其余三個治療組的表達(dá)降低(P＜0.05)，補(bǔ)腎低劑量組較疏肝組蛋白及基因表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05)，疏肝高劑量組Smad1蛋白及基因表達(dá)較疏肝低劑量組增強(qiáng)(P＜0.05)。(5)Smad5:與空白對照組比較，COH組表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各治療組蛋白及

22、mRNA表達(dá)增加，并高于COH組(P＜0.05);高劑量組表達(dá)較低劑量組升高(P＜0.05)，補(bǔ)腎高劑量組的表達(dá)高于疏肝高劑量組(P＜0.05)，疏肝低劑量組較補(bǔ)腎低劑量組表達(dá)降低(P＜0.05)。(6)Smad8:空白對照組與COH組的Smad8蛋白及mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);各治療組Smad8蛋白及mRNA表達(dá)較空白對照組和COH組升高(P＜0.05);與高劑量組比較，各低劑量組的Smad8蛋白及mRNA表達(dá)均降低(

23、P＜0.05)，補(bǔ)腎高劑量組與疏肝高劑量組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，補(bǔ)腎低劑量表達(dá)較疏肝低劑量組增強(qiáng)(P＜0.05)。(7)Smad4:與空白對照組比較，COH組蛋白及mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各治療組表達(dá)增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);高劑量組Smad4蛋白及基因表達(dá)高于低劑量組（P＜0.05），補(bǔ)腎高劑量組表達(dá)高于疏肝高劑量組(P＜0.05)，補(bǔ)腎低劑量組與疏肝低劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)