細胞黏附分子L1與動力蛋白Dynamin1相互作用調(diào)控阿爾茲海默癥發(fā)病機制.pdf

1、背景：阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種持續(xù)性神經(jīng)退行性疾病。AD的病因主要是由于可溶性的單體淀粉樣蛋白β（amyloid beta，Aβ）片段聚集，導致原纖維沉積，最終形成淀粉樣斑塊。L1神經(jīng)細胞黏附分子（L1 cell adhesion molecule，L1）是200-220 kDa跨膜糖蛋白，含有六個免疫球蛋白（Ig）樣結構域和五個纖連蛋白III型重復，以及單通道跨膜區(qū)和胞內(nèi)結構域（L1 intr

2、acellular domain，L1-ICD）。前期研究發(fā)現(xiàn)，當L1在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質中過表達時，可顯著降低AD小鼠的病理癥狀，提示L1可能在緩解AD癥狀中具有重要的生物學功能。動力蛋白Dnm1（Dynamin1）是一種100 kDa的GTP水解酶，參與網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用與囊泡循環(huán)。先前的研究發(fā)現(xiàn)抑制Dnm1的表達可以顯著降低N2a-APP695細胞中的Aβ表達水平。表明Dnm1在AD進展中發(fā)揮重要作用。因此，我們推測L1可能與D

3、nm1通過組成蛋白質復合體參與調(diào)控Aβ表達水平。研究L1和Dnm1在AD發(fā)病進程中的相互作用，及其對Aβ表達水平的調(diào)控機制，可以為L1/Dnm1作為潛在的AD臨床治療手段提供理論依據(jù)。
　　目的：研究L1和Dnm1在AD病理過程中的相互作用。
　　方法：首先我們利用免疫共沉淀和質譜分析推測可能與L1-ICD結合的分子，結果顯示在小鼠腦組織中，L1可能與Dnm1存在相互作用。我們進一步利用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡分別檢測

4、兩者在HEB細胞和U-87 MG細胞中的表達定位情況。同時，我們利用免疫共沉淀技術和GST pull-down分別在體內(nèi)和體外驗證L1與Dnm1的結合。為了表達GST-L1-ICD和Dnm1功能域重組蛋白，我們構建了質粒pET-32a-Dnm1-full-length，pET-32a-Dnm1-GTPase，pET-32a-Dnm1-MID，pET-32a-Dnm1-PH，pET-32a-Dnm1-GED，pET-32a-Dnm1-PR

5、D，以及pGEX-5X-1-L1-ICD，進而在原核表達系統(tǒng)中表達出GST-L1-ICD，His-Dnm1-GTPase，His-Dnm1-MID，His-Dnm1-PH，His-Dnm1-GED，His-Dnm1-PRD，His-Dnm1-full length，隨后通過GST pull-down實驗確定L1與Dnm1相互作用結構域。之后我們利用免疫印跡檢測過表達Dnm1后N2a細胞中APP的表達水平。免疫組化試驗檢測AD小鼠中L1與

6、Dnm1的變化情況。
　　結果：我們的研究結果顯示L1和Dnm1在神經(jīng)細胞中存在共定位。體內(nèi)和體外研究結果表明L1可以通過其細胞內(nèi)結構域直接與Dnm1相互作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)Dnm1可以通過Dnm1-GTPase蛋白質結構域直接與L1-ICD結合。在過表達Dnm1的N2a細胞中，可檢測到APP蛋白表達水平降低。與野生型相比，在AD小鼠海馬CA1區(qū)中L1蛋白水平升高，Dnm1水平降低。進而L1和Dnm1可能組成一個蛋白質復合體在AD