急性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1的動(dòng)態(tài)變化及L1-Ig1-6融合蛋白對(duì)損傷脊髓修復(fù)作用的研究.pdf

1、目的 1、觀察急性脊髓損傷后不同時(shí)相，脊髓表達(dá)L1和相關(guān)凋亡指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，研究L1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。 2、在SCI后不同時(shí)相，對(duì)脊髓L1和GAP-43的表達(dá)進(jìn)行觀察，建立L1和GAP-43的核酸和蛋白的表達(dá)曲線，并探討這兩種表達(dá)曲線的意義。 3、通過NF、GFAP、c-fos、bcl-2、bax的免疫組化、紅核脊髓束的HRP逆行示蹤以及行為學(xué)評(píng)分等資料，評(píng)價(jià)L1融合蛋白(His-Ig1-6)對(duì)神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)

2、的作用。 方法 1.利用改良的Allen's打擊法建立大鼠脊髓中等度挫裂傷模型。 2.采用RT-PCR和免疫組化染色(SABC方法)分別觀察SCI后L1、c-fos、bcl-2、bax的mRNA和蛋白表達(dá)；用凝膠掃描成像處理系統(tǒng)(Tanon系統(tǒng))對(duì)L1、c-fos、bcl-2、bax和β-actin的凝膠圖像進(jìn)行掃描，求出電泳條帶的平均光密度與面積，用平均光密度與面積的乘積代表PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的含量，以β-acti

3、n(β-肌動(dòng)蛋白)作為內(nèi)參，計(jì)算出L1和c-fos、bcl-2、bax表達(dá)量與β-actin的比值；采用NYD-1000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，測(cè)定免疫組化切片上陽性染色面積和平均光密度值。對(duì)RT-PCR和免疫組化的測(cè)得結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析；建立L1和bcl-2/bax表達(dá)的散點(diǎn)圖，用線性相關(guān)分析研究兩者的相關(guān)性。 3.對(duì)RT-PCR和免疫組化的結(jié)果進(jìn)行灰度半定量和平均光密度值檢測(cè)，觀4察SCI后L1和GAP-43在12周內(nèi)的動(dòng)態(tài)變

4、化；建立脊髓損傷遠(yuǎn)端L1和GAP-43的變化曲線；對(duì)比脊髓損傷后，遠(yuǎn)近端L1和GAP-43各自的表達(dá)情況。 4.①根據(jù)研究的需要，將動(dòng)物分為假手術(shù)組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組；②在Allen's打擊模型的L5、6棘突間隙蛛網(wǎng)膜下腔留置導(dǎo)管，建立定時(shí)給藥的通路；③采用斜板試驗(yàn)和BBB行為學(xué)評(píng)分評(píng)價(jià)治療前后神經(jīng)功能的改變；④對(duì)比治療前后NF、GFAP免疫組化陽性細(xì)胞蛋白吸光度的變化；⑤觀察c-fos、bcl-2、bax在融合蛋白治療前后的變化

5、，同時(shí)對(duì)切片的蛋白吸光度進(jìn)行對(duì)比研究；⑥應(yīng)用HRP逆行示蹤方法觀察His-Ig1-6融合蛋白抑制紅核脊髓束逆行潰變的情況，對(duì)紅核和紅核脊髓束的形態(tài)和數(shù)量進(jìn)行觀察，對(duì)單位面積上的紅核殘存細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并進(jìn)行假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的對(duì)比研究。 結(jié)果 1.SCI后L1和c-fos、bcl-2、baxmRNA和蛋白表達(dá)的變化 ①SCI后，c-fosmRNA在SCI后30min、2h、4h、6h、8h均有表達(dá)，隨時(shí)間的推

6、移逐漸升高，4h達(dá)到高峰，后逐漸下降，與對(duì)照組相比，各檢測(cè)時(shí)相均有極顯著的差異(p＜0.01)； ②bcl-2mRNA在脊髓損傷后12h、24h、3d、7d、2w、3w均有表達(dá)，隨時(shí)間的推移逐漸升高，3d達(dá)到高峰后逐漸下降。與對(duì)照組相比，8h有顯著性差異(p＜0.05)，其余各檢測(cè)時(shí)相均有極顯著的差異(p＜0.01)； ③baxmRNA在SCI后30min、2h、4h、8h、12h、24h、3d、7d、2w、3w均有表達(dá)

7、，隨時(shí)間的推移逐漸升高，8h達(dá)到高峰，后逐漸下降；與對(duì)照組相比，各時(shí)相點(diǎn)均有極顯著性意義(p＜0.01)； ④L1mRNA在傷后8h表達(dá)有所增高，峰值在1-2w出現(xiàn)，其后維持高水平的表達(dá)。與對(duì)照組相比，8h有顯著性差異(p＜0.05)，其余各檢測(cè)時(shí)相均有極顯著的差異(p＜0.01)； ⑤在SCI后12h、24h、3d、7d、2w、3w，L1/β-actin和bcl-2/bax的核酸表達(dá)呈線性正相關(guān)，r=0.893，計(jì)算相

8、關(guān)系數(shù)r的t值，tr=6.835，p＜0.001。L1蛋白表達(dá)與bcl-2/bax亦呈線性正相關(guān)。相關(guān)系數(shù)r=0.786，tr=6.316，p＜0.001。說明L1與bcl-2/bax這兩種變量關(guān)系密切。 2.SCI后脊髓傷區(qū)內(nèi)L1和GAP-43的變化 5觀察脊髓損傷后，各時(shí)相點(diǎn)(8h、12h、24h、3d、7d、2w、3w、4w、6w、8w、12w)L1和GAP-43mRNA的表達(dá)變化。L1mRNA在傷后8h表達(dá)有所增

9、高，峰值在1-2w出現(xiàn)，其后出現(xiàn)平臺(tái)期；GAP-43mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)在SCI后1-2w達(dá)到峰值，隨后出現(xiàn)漸進(jìn)性下降，到10-12w降至正常水平；脊髓遠(yuǎn)端L1和GAP-43mRNA的表達(dá)水平較近側(cè)高(p＜0.05)。遠(yuǎn)近段表達(dá)曲線有相似之處，但近端表達(dá)峰值推后。L1和GAP-43蛋白表達(dá)峰值時(shí)相較核酸表達(dá)延遲約1周。 3.L1融合蛋白(His-Ig1-6)對(duì)神經(jīng)再生作用研究 ①斜板試驗(yàn)評(píng)分 傷后3d時(shí)，His-I

10、g1-6組大鼠斜板傾斜的臨界角度和對(duì)照組都無明顯上升，兩組角度分別為29.8±1.5和29.3±2.2(P＞0.05)。3-6d后，后肢功能逐步恢復(fù)，His-Ig1-6組評(píng)分高于對(duì)照組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。His-Ig1-6組和對(duì)照組相比，在第1，2周，出現(xiàn)顯著性差異(p＜0.05)；在第3周開始出現(xiàn)極顯著性差異(p＜0.01)；以后的時(shí)相點(diǎn)上，存在顯著差異(p＜0.05)。 ②脊髓損傷后大鼠BBB評(píng)分 傷

11、后1周時(shí)，His-Ig1-6組大鼠BBB評(píng)分較對(duì)照組上升明顯，兩組分別為3.2±1.0和2.5±1.2，存在顯著差異(P＜0.05)，BBB評(píng)分的結(jié)果與斜板試驗(yàn)基本相似，在第2、3周時(shí)His-Ig1-6組大鼠的后肢運(yùn)恢復(fù)較好(p＜0.01)，在4周以后兩者仍存在顯著差異(p＜0.05)。 ③NF免疫組化研究 通過NF的免疫組化染色顯示；假手術(shù)組中，脊髓縱切面脊髓白質(zhì)中神經(jīng)軸突排列整齊且密集。在第1、2周，His-Ig1-

12、6組出現(xiàn)NF染色加深，積分吸光度顯著增高，與假手術(shù)組和對(duì)照組有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。在4～6周時(shí)，His-Ig1-6組和對(duì)照組的脊髓損傷節(jié)段中可見蛋白平均吸光度增強(qiáng)，兩者和假手術(shù)組之間均存在極顯著差異(p＜0.01)；而該時(shí)段His-Ig1-6組和對(duì)照組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。 ④GFAP的免疫組化研究 對(duì)照組GFAP的表達(dá)則在1d～14d呈進(jìn)行性增高趨勢(shì)，到2w達(dá)到峰值水平，4～6w表達(dá)

13、有所下降，但下降水平較慢。His-Ig1-6組，在治療后的第1、4d，與對(duì)照組相比無明顯差異。傷后1w，兩者的差異顯著(p＜0.05)，傷后4w、6w則有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。 ⑤His-Ig1-6組治療前相關(guān)凋亡指標(biāo)的改變 對(duì)照組c-fos基因在不同時(shí)相點(diǎn)(傷后30min、2h、4h、8h、12h、18h、24h、3d)均有表達(dá)，His-Ig1-6組c-fos陽性表達(dá)細(xì)胞在各時(shí)相點(diǎn)均明顯減少，和假手術(shù)組間

14、有極顯著的差異(P＜0.01)；傷后30min與對(duì)照組相比無顯著性差異(p＞0.05)，而4h、24h與對(duì)照組相比有顯著的差異(p＜0.05)，其余各時(shí)相點(diǎn)與對(duì)照組均有極顯著性差異(p＜0.01)；bcl-2在各時(shí)相上(12h、18h、24h、3d、1w、2w、3w)均與假手術(shù)組有極顯著差異(p＜0.01)；His-Ig1-6組bcl-2蛋白含量在各時(shí)相點(diǎn)上均高于對(duì)照組，在12h組，兩者的差異有顯著性意義(p＜0.05)，余各時(shí)相有極顯

15、著的差異(p＜0.01)；bax在傷后(2h、4h、8h、12h、18h、24h、3d)與對(duì)照組相比，亦有極顯著差異(p＜0.01)；His-Ig1-6組與對(duì)照組平均吸光度有差異，兩者在4h，8h，12h，24h的表達(dá)有極顯著差異(p＜0.01)，3d和1w有顯著的差異(p＜0.05)。⑤脊髓損傷6周后，在假手術(shù)組大鼠的紅核脊髓束區(qū)域可見大量HRP逆行標(biāo)記的神經(jīng)元，大小、形態(tài)不同的細(xì)胞均有著色。在His-Ig1-6組和對(duì)照組大鼠的大腦紅

16、核中，HRP陽性標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目相對(duì)較少，His-Ig1-6組中HRP標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)為817.6±9.7/μm2，對(duì)照組598.4±18.2/μm2，兩者差異有極顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。 結(jié)論 1.L1和bcl-2/bax基因表達(dá)存在線性相關(guān)性提示L1的表達(dá)可以抑制脊髓神經(jīng)元的凋亡；L1激活誘導(dǎo)凋亡途徑在平衡神經(jīng)再生和凋亡關(guān)系方面具有重要意義；L1受體和凋亡基因受體的交叉支配可能是L1抑制凋亡的分子基礎(chǔ)，凋亡

17、即刻早期基因調(diào)控L1的表達(dá)，而L1也可反饋調(diào)節(jié)凋亡基因的表達(dá)。 2.在大鼠SCI后，脊髓組織中出現(xiàn)L1和GAP-43的表達(dá)。GAP-43mRNA和蛋白的表達(dá)分別在第1w和第2w達(dá)到峰值后，到第12w時(shí)逐漸降至正常水平；L1mRNA在脊髓損傷后早期即有表達(dá)，在第1-2w達(dá)到峰值，隨后出現(xiàn)平臺(tái)期。L1長時(shí)程高水平的持續(xù)表達(dá)對(duì)神經(jīng)再生可能有重要意義；L1和GAP-43在中樞神經(jīng)損傷的再生過程中不可或缺。 3.His-Ig1-6