類泛素化修飾抑制劑MLN4924通過阻止BRCA1復合體募集抑制DNA雙鏈斷裂修復.pdf

1、DNA雙鏈斷裂是DNA損傷最嚴重的形式，對此，細胞主要通過兩種修復途徑來應對：非同源末端連接（non-homologous end joining,NHEJ）和同源重組（homologous recombination,HR）。細胞選擇NHEJ途徑進行修復時不需要模板，所以在細胞周期全過程都可以發(fā)生，在G1期尤為顯著，是一種錯誤傾向性修復；HR修復過程需要同源的姐妹染色單體為模板合成新的DNA鏈，因此只有處于S期和G2期的細胞才有可能通

2、過此途徑進行修復，是一種無錯修復方式。
　　乳腺癌相關基因1（breast cancer associated gene1，BRCA1）是HR修復通路中的重要蛋白，它除了能夠修復損傷的DNA外，還可以激活細胞周期檢查點，是一種關鍵的抑癌基因。
　　據(jù)之前報道，類泛素化（Neddylation）反應可以調(diào)節(jié)DNA損傷修復過程，并且可能通過影響B(tài)RCA1來發(fā)揮作用。為了更深入研究Neddylation對BRCA1的影響，我們在本

3、研究中使用了MLN4924這個小分子抑制劑。MLN4924是一種有效且特異的NEDD8的小分子抑制劑，它能夠與NEDD8活化酶形成復合物，進而有效且特異地抑制NEDD8對目的蛋白的修飾。
　　考慮到NEDD8是一種類泛素，它可能會通過修飾BRCA1蛋白，進而調(diào)節(jié)同源重組修復通路。于是我們首先通過Pull-down實驗來驗證此假設，結(jié)果顯示NEDD8并不能修飾BRCA1，但這并不代表對BRCA1沒有影響。接著我們用Neddylati

4、on活化酶抑制劑MLN4924特異性抑制Neddylation反應，探討Neddylation對BRCA1復合體的影響。結(jié)果顯示Neddylation反應被抑制以后， BRCA1復合體中的蛋白組分，包括RAP80、BARD1以及BRCA1在DNA斷裂位點的募集明顯被抑制，這說明MLN4924對DNA的同源重組修復通路產(chǎn)生影響。同樣PARP的抑制劑也能抑制同源重組修復，于是我們考慮MLN4924可能與PARP的抑制劑Olaparib協(xié)同作

5、用來抑制DNA的同源重組修復，進而抑制DNA受損的腫瘤細胞的生長。為驗證這一設想，我們聯(lián)合MLN4924與Olaparib預處理A549和H1299兩種非小細胞肺癌細胞系，然后通過細胞增殖與毒性實驗（cell counting kit-8,CCK8）檢測兩種細胞的增殖，結(jié)果如我們所預料，兩者聯(lián)合用藥相比單獨用藥更有效地抑制了這兩種非小細胞肺癌細胞系的生長。進一步我們通過檢測DNA雙鏈斷裂分子標志物γH2AX，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合用藥處理細胞后，

6、細胞內(nèi)γH2AX增加的量以及殘留時間相比單獨用藥或者不用藥處理時都有顯著增加，說明實驗組中DNA的修復過程被嚴重抑制。最后我們用Kaplan-Meier繪制出肺癌病人的預后情況與NEDD8、PARPs、BRCA1三者的表達量的關系，結(jié)果呈負相關性。這些現(xiàn)象提示我們MLN4924與Olaparib聯(lián)合用藥可能會成為治療非小細胞肺癌的新策略。
　　目的：
　　1.利用MLN4924特異性抑制Neddylation反應，檢測經(jīng)IR

7、處理后人骨肉瘤細胞中BRCA1復合體部分組分蛋白在DNA損傷位點的募集情況，進而探討Neddyaltion修飾對BRCA1復合體的影響；
　　2.MLN4924和Olaparib聯(lián)合處理A549和H1299，觀察聯(lián)合用藥對兩種細胞系增殖的影響，進而探討兩者聯(lián)合用藥治療非小細胞肺癌的可能性；
　　3.通過檢測γH2AX的量及其在細胞中存在的時間長短來確定MLN4924與Olaparib聯(lián)合用藥會更大程度地影響DNA修復，進而使

8、細胞生長受到更顯著的抑制；
　　4.用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫來宏觀地判斷NEDD8、PARPs、BRCA1三者表達量與肺癌病人預后情況的關系。
　　方法：
　　分別轉(zhuǎn)染SFB空載質(zhì)粒（SFB-VEC）、SFB-NEDD8野生型質(zhì)粒（SFB-NEDD8 WT）以及SFB-NEDD8突變型質(zhì)粒（SFB-NEDD8 Mut）于293T細胞，24h后，熒光顯微鏡下檢測有綠色熒光，然后進行10Gy照射，收集照射后1h的細

9、胞，做Pull-down實驗，檢測NEDD8是否修飾BRCA1蛋白；用終濃度為3μM的MLN4924預處理U2OS細胞1h，8Gy照射，免疫熒光實驗檢測照射后6h細胞內(nèi)BRCA1的焦點；以Lipofectamin2000為轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染GFP-BARD1和GFP-XRCC1兩種質(zhì)粒到U2OS細胞，24h后利用激光微照射方法對DNA造成損傷，熒光顯微鏡下觀察GFP熒光強度并拍照；用終濃度為3μM的 MLN4924預處理U2OS細胞1h

10、，照射（8Gy），然后依次收集照射后1、2、4、8和12h的細胞沉淀，用0.2M HCL提取細胞染色體組分蛋白，以Lamin-C為內(nèi)參，通過免疫印跡法檢測募集到染色體上的RAP80的變化；用梯度濃度（0.01μM-10μM）的MLN4924和Olaparib分別處理A549和H1299兩種非小細胞肺癌細胞系，然后通過細胞增殖與毒性實驗檢測兩種細胞系的生殖情況，選擇細胞半數(shù)致死時對應的藥物濃度作為后續(xù)研究的用藥濃度，然后兩種藥物聯(lián)合用藥，

11、再次利用細胞增殖與毒性實驗檢測聯(lián)合用藥對兩種非小細胞肺癌細胞系的增殖的影響；終濃度為0.1μM的Olaparib和0.1μM的MLN4924分別或者聯(lián)合用藥預處理A549和H1299兩種細胞系1h，2Gy照射，24h后收集細胞，通過免疫熒光實驗檢測γH2AX，根據(jù)γH2AX的量及其在細胞內(nèi)存在的時間長短來判斷DNA的修復情況；利用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫說明肺癌病人的預后情況與NEDD8、BRCA1、PARPs三者在體內(nèi)表達量的關

12、系。
　　結(jié)果：
　　1.Pull-down實驗結(jié)果顯示，NEDD8不能修飾BRCA1蛋白；
　　2.抑制Neddylation修飾后，BRCA1以及BRCA1-A復合體中的BRAD1和RAP80蛋白在DNA斷裂末端的募集相比對照組受到明顯的抑制；
　　3.細胞增殖與毒性檢測實驗的結(jié)果顯示，類泛素抑制劑MLN4924與PARP1抑制劑Olaparib聯(lián)合用藥協(xié)同抑制A549和H1299兩種非小細胞肺癌細胞系的增殖

13、；
　　4.激光共聚焦實驗顯示，照射后24h在用MLN4924和Olaparib聯(lián)合用藥預處理的細胞中DNA雙鏈斷裂分子標志物γH2AX仍然存在，而在單獨用藥或者不用藥處理組中γH2AX幾乎全部消失，說明在聯(lián)合用藥處理的細胞中， DNA損傷修復過程被強烈地抑制；
　　5.Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫分析顯示，在肺癌病人中NEDD8、PARPs、BRCA1三者的表達量與患者的預后情況成負相關。
　　結(jié)論：
　　1

14、.NEDD8不是通過直接修飾BRCA1蛋白來調(diào)節(jié)同源重組修復的，但是當Neddylation反應被抑制后電離輻射引起的BRCA1、BARD1以及RAP80在DNA斷裂末端的募集被明顯抑制；
　　2.MLN4924和Olaparib兩者聯(lián)合用藥能夠嚴重阻礙DNA修復進程，進而協(xié)同抑制了A549和H1299兩種非小細胞肺癌細胞系的增殖；
　　3.NEDD8、BRCA1、PARPs基因的高表達與肺癌病人的不良預后密切相關，這提示M