PIN1通過促進(jìn)CHIP單泛素化修飾增強(qiáng)其活性.pdf

1、熱休克同源蛋白70羧基末端相互作用蛋白（carboxyl terminus of hsc70 interacting protein，CHIP）具有輔助分子伴侶和E3泛素連接酶功能。CHIP通過其氨基末端（N末端）與熱休克蛋白結(jié)合，輔助參與蛋白質(zhì)的正確折疊；同時通過其羧基末端（C末端）將泛素分子傳遞/連接至特異性底物，促進(jìn)底物經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解。在多種神經(jīng)退行性疾病中，CHIP通過其輔助分子伴侶和E3泛素連接酶功能，在抑制蛋白質(zhì)錯誤

2、折疊、促進(jìn)錯誤折疊蛋白經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解過程中均發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)CHIP N末端的單泛素化修飾能夠促進(jìn)其功能活性、增強(qiáng)其對底物的降解能力，然而關(guān)于CHIP自身的活性調(diào)節(jié)、構(gòu)象變化以及具體的激活機(jī)制還并不明確。肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶NIMA互作蛋白1（PIN1），能特異性識別底物磷酸化的Ser/Thr-Pro(SP/TP)基序（PIN1對磷酸化修飾的SP/TP基序的結(jié)合能力比非磷酸化修飾的SP/TP基序提高上千倍），促進(jìn)底物

3、的順/反異構(gòu)，進(jìn)而引起底物構(gòu)象改變。這種構(gòu)象的改變能夠改變底物的穩(wěn)定性，存在狀態(tài)及功能活性。PIN1具有兩個相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域：一個是位于其N端的雙色氨酸結(jié)構(gòu)域（WW結(jié)構(gòu)域），是PIN1識別SP/TP基序并與底物蛋白發(fā)生相互作用的主要區(qū)域；另一個是位于其 C端的親環(huán)蛋白類型肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶催化（PpiC）結(jié)構(gòu)域，是 PIN1催化底物順/反異構(gòu)的功能結(jié)構(gòu)域，也具有識別/結(jié)合底物的能力。通過對CHIP的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，CHIP中存在

4、可能被PIN1識別并催化的SP/TP基序（CHIP的一級結(jié)構(gòu)中存在四個 SP/TP基序，S19P20，S23P24，T246P247，S273P274；其中多個已經(jīng)證明能夠被磷酸化修飾）。因此，CHIP可能是PIN1的潛在底物。為了明確PIN1與CHIP之間的關(guān)系，我們分析了二者之間的相互作用及PIN1對CHIP活性的影響與相關(guān)機(jī)制。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、臥IN1與CHIP存在相互作用 PIN1能夠特異性識別SP/TP基序以

5、及CHIP結(jié)構(gòu)中存在典型的SP/TP基序提示二者之間可能存在相互作用。為了驗(yàn)證這種推測，利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）檢測內(nèi)源性PIN1與內(nèi)源性 CHIP之間的相互作用關(guān)系，用缺失突變以及點(diǎn)突變的方式檢測 PIN1與CHIP的具體相互作用位點(diǎn)。內(nèi)源性PIN1與內(nèi)源性CHIP存在相互作用：分別提取正常小鼠的腦組織和N2a細(xì)胞的蛋白進(jìn)行Co-IP，結(jié)果顯示，PIN1和CHIP存在相互作用

6、。PIN1通過其C端的肽基脯氨酰順/反異構(gòu)催化結(jié)構(gòu)域與CHIP結(jié)合：PIN1結(jié)構(gòu)中的WW結(jié)構(gòu)域和PpiC結(jié)構(gòu)域都能同其底物發(fā)生相互作用。為明確PIN1與CHIP相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建PIN1的兩個結(jié)構(gòu)域缺失型突變體質(zhì)粒mCherry-PIN1-WW和mCherry-PIN1-PpiC。與野生型CHIP的Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CHIP和PIN1的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域WW沒有相互作用，但與PIN1的催化結(jié)構(gòu)域PpiC具有明顯的相互作用。CHIP2

7、73，274號位的SP基序是其與PIN1相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)：針對CHIP一級結(jié)構(gòu)中存在的可能被PIN1識別/結(jié)合的四個SP/TP基序分別進(jìn)行點(diǎn)突變，構(gòu)建HA-CHIP-S19A，S23A，S19/23A，T246A，S273A點(diǎn)突變質(zhì)粒，分別同野生型PIN1共轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞后進(jìn)行Co-IP分析，結(jié)果顯示，CHIP273號位絲氨酸突變?yōu)楸彼幔–HIP-S273A）后，CHIP和 PIN1的相互作用明顯減弱；而其它位點(diǎn)（CHIP-S19A

8、，CHIP-S23A，CHIP-S19/23A，CHIP-T246A）的突變，對CHIP與PIN1的相互作用沒有顯著影響。由此證明，CHIP的273，274號位SP基序是CHIP與PIN1相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　?、芇IN1通過促進(jìn)CHIP對突變ataxin-3的泛素化修飾而增強(qiáng)突變ataxin-3的降解 PIN1與CHIP之間的相互作用提示PIN1可能影響CHIP的活性。為了明確PIN1對CHIP活性的影響，檢測不同PIN1表達(dá)

9、水平對CHIP的底物，導(dǎo)致第3型脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)癥（Spinocerebellar ataxia，SCA3）的突變ataxin-3降解作用的影響。PIN1促進(jìn)突變ataxin-3蛋白水平降低:免疫印跡檢測顯示，在轉(zhuǎn)染表達(dá)突變ataxin-3(80Q-ataxin-3)的N2a細(xì)胞中，過表達(dá)PIN1使聚集型和非聚集型80Q-ataxin-3水平均明顯降低，而在轉(zhuǎn)染表達(dá)80Q-ataxin-3的N2a細(xì)胞中沉默CHIP后，過表達(dá)PIN1降低

10、聚集型80Q-ataxin-3的作用無明顯變化，但降低非聚集型80Q-ataxin-3的作用受到顯著抑制。因此，PIN1能夠通過 CHIP促進(jìn)80Q-ataxin-3蛋白水平的降低。PIN1促進(jìn)突變ataxin-3的泛素化：為了明確PIN1促進(jìn)突變ataxin-3的降解是否因其通過CHIP的E3泛素連接酶活性使突變ataxin-3泛素化增強(qiáng)所致，我們檢測了不同PIN1蛋白表達(dá)水平對突變ataxin-3泛素化修飾的影響。對免疫沉淀的80Q

11、-ataxin-3進(jìn)行泛素化水平免疫印跡檢測顯示，過表達(dá)PIN1顯著增加80Q-ataxin-3的泛素化水平，沉默PIN1則使80Q-ataxin-3的泛素化水平顯著降低。因此，PIN1能促進(jìn)突變ataxin-3的泛素化修飾。PIN1促進(jìn)CHIP的總泛素化修飾：E3泛素連接酶的基本催化模式是將活化的泛素分子連接到自身，再傳遞/連接到特異性底物，因此E3泛素連接酶的功能活化都會發(fā)生自身泛素化修飾水平的改變；PIN1能夠調(diào)控P53的泛素化水

12、平從而增強(qiáng)P53的活性。那么PIN1能否促進(jìn)E3泛素連接酶CHIP的泛素化修飾進(jìn)而影響其活性呢？在 N2a細(xì)胞中同時過表達(dá) PIN1和 CHIP，通過對 CHIP自身總泛素化水平的檢測顯示，過表達(dá)PIN1能顯著增加CHIP的自身泛素化水平，而沉默PIN1則明顯降低CHIP的自身泛素化水平。繼而在N2a細(xì)胞中同時過表達(dá) PIN1以及可能和 PIN1結(jié)合的CHIP序列上的SP/TP點(diǎn)突變質(zhì)粒（HA-CHIP-S19A，S23A，S19/23

13、A，T246A，S273A），對免疫共沉淀的CHIP泛素化水平檢測顯示，CHIP中與PIN1結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)（S273A）突變后，CHIP自身泛素化水平明顯降低，說明PIN1與CHIP的結(jié)合能力影響CHIP的自身泛素化修飾。由此進(jìn)一步證明，PIN1通過與CHIP上的SP/TP基序結(jié)合促進(jìn)其泛素化，進(jìn)而增強(qiáng)其E3泛素連接酶活性，促進(jìn)其底物的泛素化和降解。
　?、荘IN1通過促進(jìn)CHIP單泛素化修飾增強(qiáng)其活性 CHIP功能活性調(diào)節(jié)的相關(guān)

14、研究發(fā)現(xiàn)，位于CHIP N末端的2、4、7號位賴氨酸殘基（K2、K4、K7）可以發(fā)生單泛素化修飾；單泛素化修飾能夠增強(qiáng)CHIP的功能活性。單泛素化修飾位點(diǎn)的突變可以抑制CHIP對底物的催化降解能力：為明確2，4，7號位賴氨酸（K）的單泛素化修飾是否參與調(diào)解 CHIP對底物（80Q-ataxin-3）的催化降解。將這3個賴氨酸進(jìn)行點(diǎn)突變，分別構(gòu)建 CHIP的點(diǎn)突變質(zhì)粒（HA-CHIP-K2R、K4R、K7R、K2/4/7R）。將這些點(diǎn)突變

15、質(zhì)粒與突變ataxin-3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞后，免疫印跡結(jié)果顯示，野生型CHIP可以顯著減少突變ataxin-3；K2R突變后未對CHIP的相應(yīng)功能造成影響；K4R，K7R突變后，CHIP促進(jìn)突變 ataxin-3降解的能力較野生型明顯下降；值得注意的是，K2/4/7R突變后（CHIP單泛素化修飾位點(diǎn)完全突變）CHIP徹底失去了對突變ataxin-3的催化降解能力。這說明 CHIP的單泛素化是調(diào)解其功能活性，促進(jìn)底物降解的關(guān)鍵性修飾。

16、PIN1促進(jìn)CHIP單泛素化修飾：以上結(jié)果說明CHIP N末端的單泛素化修飾確實(shí)是其功能活性的重要調(diào)節(jié)因素，那么PIN1對CHIP的活性增強(qiáng)作用是否也與CHIP的單泛素化修飾水平有關(guān)呢？為此我們檢測了PIN1的不同表達(dá)水平對CHIP單泛素化修飾的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá)PIN1促進(jìn)CHIP的單泛素化修飾；而干擾PIN1后，CHIP單泛素化修飾水平降低。這說明PIN1可以促進(jìn)CHIP的單泛素化修飾。
　?、萈IN1增加CHIP的穩(wěn)定性

17、我們前期工作中發(fā)現(xiàn)，PIN1能夠提高CHIP的蛋白水平而對CHIP的mRNA水平?jīng)]有影響，由此提示PIN1可能在翻譯后水平影響CHIP蛋白水平變化，為此，在過表達(dá)PIN1的細(xì)胞中加入蛋白合成抑制劑放線菌酮(Chlorhexidine Dihydrochloride，CHX)，檢測不同時間點(diǎn)（0 h，3 h，6 h，9 h，12 h）CHIP蛋白的降解代謝情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PIN1后，CHIP蛋白代謝降解速度減慢，說明，過表達(dá)PIN1增

18、強(qiáng)了CHIP的蛋白穩(wěn)定性。證明了PIN1和CHIP之間存在著相互作用，該作用位點(diǎn)分別位于PIN1的PpiC結(jié)構(gòu)域和CHIP的S273P274基序；PIN1能夠增強(qiáng)CHIP總泛素化修飾進(jìn)而增強(qiáng)CHIP對其底物的泛素化修飾和降解；PIN1通過增強(qiáng)CHIP的單泛素化修飾增強(qiáng)CHIP功能活性；PIN1在增強(qiáng)CHIP功能活性的同時，還能增強(qiáng)CHIP的蛋白穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明，CHIP有可能是PIN1的一個新的催化底物，PIN1與CHIP相互作用以