Nrf2通過(guò)調(diào)控Trx1-TXNIP復(fù)合物抑制腦缺血再灌注損傷后NLRP3炎性復(fù)合體的活化.pdf

1、背景：
　　NLRP3（NOD-like receptor pyrin domain containing three）為胞漿內(nèi)模式識(shí)別受體NOD樣受體家族當(dāng)中的一員；NLRP3在應(yīng)激狀態(tài)下可以發(fā)生自身寡聚化，在凋亡相關(guān)微粒蛋白ASC（apoptosis—associated speck-like protein containing）幫助下募集pro-caspase1形成NLRP3炎性復(fù)合體。既往研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性復(fù)合體的活

2、化在缺血再灌注損傷當(dāng)中起到重要的作用，但至今上游的調(diào)控機(jī)制尚未明確，因此，尋找能夠抑制NLRP3炎性復(fù)合體活化的負(fù)性調(diào)控因子并闡明其調(diào)控的機(jī)制具有重要意義。
　　目的：
　　探討在大鼠腦缺血再灌注損傷中Nrf2能否通過(guò)調(diào)控Trx1/TXNIP復(fù)合物抑制NLRP3炎性復(fù)合體的活化及其作用機(jī)制
　　方法：
　?。?）運(yùn)用Longa線(xiàn)栓法對(duì)SD大鼠進(jìn)行大腦中動(dòng)脈栓塞（Middle Cerebral Artery Occ

3、lusion,MCAO）模型的建立。篩選在腦缺血再灌注損傷后NLRP3表達(dá)最高時(shí)間點(diǎn)：分別于模型建立后4h、8h、12h、24h、48h進(jìn)行麻醉、生理鹽水灌注、斷頭后取腦，腦組織用于之后的Western blot分析。
　　（2）合成特異性 NLRP3 siRNA(NLRP3_1980、NLRP3_2185、NLRP3_2262)與用于對(duì)照組的 control siRNA,并于 MCAO模型建立前24h進(jìn)行siRNA的側(cè)腦室注射，

4、利用Western blot篩選出干擾效果最佳的NLRP3 siRNA片段。
　?。?）利用Western blot對(duì)Sham、MCAO、MCAO+control siRNA、MCAO+NLRP3 siRNA組檢測(cè)NRLP3炎性復(fù)合體的表達(dá)，與其下游的炎性因子IL-1β與IL-18與Caspase-1的表達(dá)，觀(guān)察各組中建模后神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，利用TTC染色檢測(cè)大鼠腦梗死體積，并使用ELISA法檢測(cè)IL-18、IL-1β的蛋白濃度。<

5、br>　?。?）合成特異性Trx1 siRNA建立Trx1干擾的大鼠MCAO模型，利用RT-qPCR與Western Blot驗(yàn)證其干擾效果，并使用Western blot檢測(cè)Sham、MCAO、MCAO+control siRNA、MCAO+Trx1 siRNA各組中Trx1、NLRP3炎性復(fù)合體與胞漿、胞核中TXNIP的表達(dá)。
　?。?）合成特異性Nrf2 siRNA進(jìn)行Nrf2干擾的大鼠MCAO模型的建立，并使用tBHQ誘導(dǎo)

6、Nrf2激活的大鼠MCAO模型，將tBHQ溶于二甲亞砜（DMSO），tBHQ在建模前24h進(jìn)行第一次腹腔注射，共三次，每次間隔8h，使用Western blot與RT-qPCR進(jìn)行Nrf2干擾與激活效果的驗(yàn)證，并檢測(cè)Sham、MCAO、MCAO+DMSO、MCAO+tBHQ、MCAO+control siRNA、MCAO+NLRP3 siRNA組中，Nrf2、NLRP3、Caspase-1以及炎性因子IL-1β、IL-18的表達(dá)，并用E

7、LISA法檢測(cè)IL-β、IL-18蛋白濃度。
　?。?）建立Trx1干擾的tBHQ激活Nrf2的大鼠MCAO模型，在Sham、MCAO、MCAO+DMSO、MCAO+tBHQ、MCAO+control siRNA、MCAO+Nrf2 siRNA、MCAO+tBHQ+Trx1 siRNA組中利用Western Blot檢測(cè)TXNIP在胞漿以及胞核當(dāng)中的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）NLRP3炎性復(fù)合體的表達(dá)在I/R損傷后

8、于24小時(shí)達(dá)到頂峰，之后至48小時(shí)呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。
　?。?）在特異性干擾片段中，NLRP3_2185干擾效果最明顯，達(dá)65%以上。
　　（3）MCAO與MCAO+control siRNA組相比無(wú)干擾效果，且兩組與MCAO+NLRP3 siRNA相比，干擾NLRP3后，Caspase-1表達(dá)下降，下游炎癥因子IL-18與IL-1β表達(dá)減少，腦梗死體積明顯減小，行為學(xué)缺損也有所改善。
　　（4）MCAO+Trx1 s

9、iRNA組與MCAO組相比之下，Trx1干擾組中NLRP3炎性復(fù)合體表達(dá)有所上升，胞核當(dāng)中 TXNIP表達(dá)減少，胞漿當(dāng)中TXNIP表達(dá)上升。
　?。?）MCAO+DMSO組與MCAO組相比較下Nrf2表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，MCAO+DMSO組與MCAO+tBHQ組相比較下，Nrf2在后者組中表達(dá)量明顯上升，除胞核當(dāng)中TXNIP表達(dá)有所上升外，NLRP3炎性復(fù)合體、胞漿中TXNIP、Caspase-1、IL-18、IL-1β表達(dá)量明顯下

10、降，反之，MCAO+Nrf2 siRNA與MCAO+control siRNA相比下，Nrf2干擾片段可明顯降低Nrf2表達(dá)，且除胞核當(dāng)中TXNIP表達(dá)有所下降外，NLRP3炎性復(fù)合體、胞漿當(dāng)中TXNIP、Caspase-1、IL-18、IL-1β表達(dá)量明顯上升。另外，MCAO+tBHQ+Trx1 siRNA組與MCAO+tBHQ組相比下，干擾Trx1的Nrf2激動(dòng)組中TXNIP在胞漿當(dāng)中的表達(dá)明顯升高，且在胞核當(dāng)中的表達(dá)明顯下降。