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文檔簡介
1、目的:維持性血液透析(maintenance hemodialysis, MHD)患者的全因死亡率逐年上升,其中心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是MHD患者的主要死亡原因之一,而血管鈣化是其最常見的病理表現(xiàn),據(jù)統(tǒng)計表明,血管鈣化導(dǎo)致的死亡率約占MHD患者總病死率的30%左右。影響MHD患者血管鈣化的危險因素眾多,如高齡、貧血、高脂血癥、高磷血癥以及長透析齡等危險因素。但傳統(tǒng)危險因素已不能完全解釋MHD
2、患者血管鈣化,因此,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),酸性環(huán)境抑制VSMCs鈣化,堿性環(huán)境促進(jìn)VSMCs鈣化。然而,間歇性堿刺激對VSMCs鈣化的影響及其可能的機(jī)制尚未完全明確,因此本研究將通過模擬MHD患者體內(nèi)特有的pH變化規(guī)律,探討間歇性堿刺激對VSMCs鈣化的影響及可能機(jī)制。
方法:
1.VSMCs的原代培養(yǎng)及實驗分組
將血管外膜輕輕剝除,縱行剖開血管,用無菌紗布輕輕擦除內(nèi)膜,應(yīng)用組織貼壁法進(jìn)行VSMCs原代培養(yǎng)
3、,并進(jìn)行鑒定。經(jīng)自然純化后,選取生長良好的4代細(xì)胞進(jìn)行實驗。采用隨機(jī)數(shù)字表法,將VSMCs隨機(jī)分為6組:正常對照組、高磷+pH7.4組、高磷+pH7.5組、高磷+pH7.6組、高磷+pH7.7組及維拉帕米干預(yù)組。干預(yù)4 d后,提取各組細(xì)胞mRNA和蛋白,進(jìn)行RNA及蛋白水平檢測,干預(yù)14 d后進(jìn)行鈣化檢測。
2.血管環(huán)的培養(yǎng)及實驗分組
體外分離大鼠胸主動脈血管環(huán),采用隨機(jī)數(shù)字表法,將VSMCs隨機(jī)分為6組:正常對照組
4、、高磷+pH7.4組、高磷+pH7.5組、高磷+pH7.6組、高磷+pH7.7組及維拉帕米干預(yù)組。干預(yù)14天后,用組織免疫組化方法檢測LTCCβ3、SM22α和Runx2表達(dá)情況,并進(jìn)行鈣化檢測。
3.RT-PCR和Western印跡法檢測各目的基因及蛋白的表達(dá)
細(xì)胞干預(yù)4天后,分別提取正常對照組、高磷+pH7.4組、高磷+pH7.5組、高磷+pH7.6組、高磷+pH7.7組及維拉帕米干預(yù)組mRNA和蛋白,用RT-P
5、CR和Western Blot方法測定L型鈣通道(calcium channels, L-type, LTCC)β3亞基和Runx2的表達(dá)情況。
4.免疫組化方法檢測血管環(huán)各目的蛋白表達(dá)
取石蠟切片(3μm)常規(guī)脫蠟,用EDTA高壓鍋煮沸抗原修復(fù),3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,山羊血清封閉,滴加一抗:LTCCβ3亞基(1:50)、Runx2(1:100)、SM22α(1:100),放入4℃過夜;滴加第二代生物素標(biāo)
6、記的二抗工作液和辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液,DAB顯色,顯微鏡下觀察,蒸餾水終止反應(yīng),蘇木素復(fù)染,明顯棕黃色顆粒為陽性,不著色為陰性。
5.VSMCs鈣化情況及ALP活性測定
VSMCs鈣含量測定:細(xì)胞干預(yù)14天,用BCA法測定細(xì)胞鈣含量,鈣含量(mg/g)用蛋白含量校準(zhǔn)。茜素紅染色:細(xì)胞干預(yù)14天,加入茜素紅染液,放入37℃溫箱賦育30 min,橘紅色為鈣鹽沉積。ALP活性測定:使用ALP活性試劑盒測定其活性,結(jié)果
7、用蛋白含量校準(zhǔn)。
6.血管環(huán)鈣化情況測定
血管環(huán)鈣含量測定:血管環(huán)干預(yù)14天后用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測定鈣含量,以mg/g為單位。硝酸銀鈣化染色:血管環(huán)干預(yù)14天后常規(guī)脫蠟、脫水,滴加5%硝酸銀溶液,紫外光照射60 min,5%硫代硫酸鈉溶液定影,堿性品紅復(fù)染,鈣鹽沉積處被染為黑褐色。
7.VSMCs鈣離子濃度測定
細(xì)胞干預(yù)4天后,使用鈣離子探針技術(shù)檢測VSMCs內(nèi)鈣離子濃度。
8.統(tǒng)計
8、學(xué)處理
應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析,實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間均數(shù)差異比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA),組間均數(shù)兩兩比較應(yīng)用SNK檢驗,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
1.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化影響
VSMCs茜素紅染色與鈣含量測定結(jié)果一致,與正常對照組相比,高磷+pH7.4組鈣鹽沉積增多(P<0.05);與高磷+pH7.4組相比,高磷+p
9、H7.5組鈣鹽沉積增多(P<0.05);與高磷+pH7.5組相比,高磷+pH7.6組鈣鹽沉積增多(P<0.05);與高磷+pH7.6組相比,高磷+pH7.7組鈣鹽沉積增多(P<0.05);與高磷+pH7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組鈣鹽沉積減少(P<0.05)。
2.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)鈣化影響
血管環(huán)Von Kossa染色與鈣含量測定結(jié)果一致,與正常對照組相比,高磷+pH7.4組鈣化結(jié)節(jié)增多(P<0.05);
10、與高磷+pH7.4組相比,高磷+pH7.5組鈣化結(jié)節(jié)增多(P<0.05);與高磷+pH7.5組相比,高磷+pH7.6組鈣化結(jié)節(jié)增多(P<0.05);與高磷+pH7.6組相比,高磷+pH7.7組鈣化結(jié)節(jié)增多(P<0.05);與高磷+pH7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組鈣化結(jié)節(jié)減少(P<0.05)。
3.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的VSMCs Runx2表達(dá)和ALP活性的影響
RT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示,與
11、正常對照組相比,高磷+pH7.4組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.4組相比,高磷+pH7.5組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.5組相比,高磷+pH7.6組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.6組相比,高磷+pH7.7組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組Runx2表達(dá)水平降低(P<0.05)。ALP活性測定結(jié)果顯示,間歇性堿刺
12、激增加ALP活性(P<0.05),維拉帕米抑制ALP活性(P<0.05)。
4.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)Runx2和SM22α表達(dá)的影響
免疫組化結(jié)果顯示,與正常對照組相比,高磷+pH7.4組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05),SM22α表達(dá)水平降低(P<0.05);與高磷+pH7.4組相比,高磷+pH7.5組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05),SM22α表達(dá)水平降低(P<0.05);與高磷+pH7.5
13、組相比,高磷+pH7.6組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05),SM22α表達(dá)水平降低(P<0.05);與高磷+pH7.6組相比,高磷+pH7.7組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05), SM22α表達(dá)水平降低(P<0.05);與高磷+pH7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組Runx2表達(dá)水平降低(P<0.05),SM22α表達(dá)水平增高(P<0.05)。
5.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的VSMCs的LTCCβ3亞基表達(dá)及鈣離子內(nèi)流效應(yīng)
14、的影響
RT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示,與正常對照組相比,高磷+pH7.4組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.4組相比,高磷+pH7.5組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.5組相比,高磷+pH7.6組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.6組相比,高磷+pH7.7組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.7組
15、相比,維拉帕米干預(yù)組LTCCβ3亞基表達(dá)水平降低(P<0.05)。熒光顯色結(jié)果顯示,間歇性堿刺激增加VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度(P<0.05),維拉帕米抑制減少VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度(P<0.05)。
6.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)LTCCβ3亞基表達(dá)的影響
免疫組化結(jié)果顯示,與正常對照組相比,高磷+pH7.4組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.4組相比,高磷+pH7.5組LTCC
16、β3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.5組相比,高磷+pH7.6組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.6組相比,高磷+pH7.7組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05);與高磷+pH7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組LTCCβ3亞基表達(dá)水平降低(P<0.05)。
結(jié)論:間歇性堿刺激促進(jìn)高磷誘導(dǎo)的VSMCs的血管鈣化,其機(jī)制可能與間歇性堿刺激上調(diào)L型鈣通道β3亞基表達(dá),進(jìn)而增加鈣離子內(nèi)流
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