間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：維持性血液透析(maintenance hemodialysis, MHD)患者的全因死亡率逐年上升，其中心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是MHD患者的主要死亡原因之一，而血管鈣化是其最常見的病理表現(xiàn)，據(jù)統(tǒng)計表明，血管鈣化導(dǎo)致的死亡率約占MHD患者總病死率的30％左右。影響MHD患者血管鈣化的危險因素眾多，如高齡、貧血、高脂血癥、高磷血癥以及長透析齡等危險因素。但傳統(tǒng)危險因素已不能完全解釋MHD

2、患者血管鈣化，因此，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境抑制VSMCs鈣化，堿性環(huán)境促進(jìn)VSMCs鈣化。然而，間歇性堿刺激對VSMCs鈣化的影響及其可能的機(jī)制尚未完全明確，因此本研究將通過模擬MHD患者體內(nèi)特有的pH變化規(guī)律，探討間歇性堿刺激對VSMCs鈣化的影響及可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.VSMCs的原代培養(yǎng)及實驗分組
　　將血管外膜輕輕剝除，縱行剖開血管，用無菌紗布輕輕擦除內(nèi)膜，應(yīng)用組織貼壁法進(jìn)行VSMCs原代培養(yǎng)

3、，并進(jìn)行鑒定。經(jīng)自然純化后，選取生長良好的4代細(xì)胞進(jìn)行實驗。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將VSMCs隨機(jī)分為6組：正常對照組、高磷+pH7.4組、高磷+pH7.5組、高磷+pH7.6組、高磷+pH7.7組及維拉帕米干預(yù)組。干預(yù)4 d后，提取各組細(xì)胞mRNA和蛋白，進(jìn)行RNA及蛋白水平檢測，干預(yù)14 d后進(jìn)行鈣化檢測。
　　2.血管環(huán)的培養(yǎng)及實驗分組
　　體外分離大鼠胸主動脈血管環(huán)，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將VSMCs隨機(jī)分為6組：正常對照組

4、、高磷+pH7.4組、高磷+pH7.5組、高磷+pH7.6組、高磷+pH7.7組及維拉帕米干預(yù)組。干預(yù)14天后，用組織免疫組化方法檢測LTCCβ3、SM22α和Runx2表達(dá)情況，并進(jìn)行鈣化檢測。
　　3.RT-PCR和Western印跡法檢測各目的基因及蛋白的表達(dá)
　　細(xì)胞干預(yù)4天后，分別提取正常對照組、高磷+pH7.4組、高磷+pH7.5組、高磷+pH7.6組、高磷+pH7.7組及維拉帕米干預(yù)組mRNA和蛋白，用RT-P

5、CR和Western Blot方法測定L型鈣通道(calcium channels, L-type, LTCC)β3亞基和Runx2的表達(dá)情況。
　　4.免疫組化方法檢測血管環(huán)各目的蛋白表達(dá)
　　取石蠟切片(3μm)常規(guī)脫蠟，用EDTA高壓鍋煮沸抗原修復(fù)，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加一抗：LTCCβ3亞基(1:50)、Runx2(1:100)、SM22α(1:100)，放入4℃過夜；滴加第二代生物素標(biāo)

6、記的二抗工作液和辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，DAB顯色，顯微鏡下觀察，蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，明顯棕黃色顆粒為陽性，不著色為陰性。
　　5.VSMCs鈣化情況及ALP活性測定
　　VSMCs鈣含量測定：細(xì)胞干預(yù)14天，用BCA法測定細(xì)胞鈣含量，鈣含量（mg/g）用蛋白含量校準(zhǔn)。茜素紅染色：細(xì)胞干預(yù)14天，加入茜素紅染液，放入37℃溫箱賦育30 min，橘紅色為鈣鹽沉積。ALP活性測定：使用ALP活性試劑盒測定其活性，結(jié)果

7、用蛋白含量校準(zhǔn)。
　　6.血管環(huán)鈣化情況測定
　　血管環(huán)鈣含量測定：血管環(huán)干預(yù)14天后用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測定鈣含量，以mg/g為單位。硝酸銀鈣化染色：血管環(huán)干預(yù)14天后常規(guī)脫蠟、脫水，滴加5%硝酸銀溶液，紫外光照射60 min，5%硫代硫酸鈉溶液定影，堿性品紅復(fù)染，鈣鹽沉積處被染為黑褐色。
　　7.VSMCs鈣離子濃度測定
　　細(xì)胞干預(yù)4天后，使用鈣離子探針技術(shù)檢測VSMCs內(nèi)鈣離子濃度。
　　8.統(tǒng)計

8、學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)差異比較應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA），組間均數(shù)兩兩比較應(yīng)用SNK檢驗，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化影響
　　VSMCs茜素紅染色與鈣含量測定結(jié)果一致，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組鈣鹽沉積增多(P<0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+p

9、H7.5組鈣鹽沉積增多(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組鈣鹽沉積增多(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組鈣鹽沉積增多(P<0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預(yù)組鈣鹽沉積減少(P<0.05)。
　　2.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)鈣化影響
　　血管環(huán)Von Kossa染色與鈣含量測定結(jié)果一致，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組鈣化結(jié)節(jié)增多(P<0.05)；

10、與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組鈣化結(jié)節(jié)增多(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組鈣化結(jié)節(jié)增多(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組鈣化結(jié)節(jié)增多(P<0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預(yù)組鈣化結(jié)節(jié)減少(P<0.05)。
　　3.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的VSMCs Runx2表達(dá)和ALP活性的影響
　　RT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示，與

11、正常對照組相比，高磷+pH7.4組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組Runx2表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預(yù)組Runx2表達(dá)水平降低(P<0.05)。ALP活性測定結(jié)果顯示，間歇性堿刺

12、激增加ALP活性(P<0.05)，維拉帕米抑制ALP活性(P<0.05)。
　　4.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)Runx2和SM22α表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組Runx2表達(dá)水平增高(P＜0.05)，SM22α表達(dá)水平降低(P＜0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組Runx2表達(dá)水平增高(P＜0.05)，SM22α表達(dá)水平降低(P＜0.05)；與高磷+pH7.5

13、組相比，高磷+pH7.6組Runx2表達(dá)水平增高(P＜0.05)，SM22α表達(dá)水平降低(P＜0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組Runx2表達(dá)水平增高(P＜0.05)， SM22α表達(dá)水平降低(P＜0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預(yù)組Runx2表達(dá)水平降低(P＜0.05)，SM22α表達(dá)水平增高(P＜0.05)。
　　5.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的VSMCs的LTCCβ3亞基表達(dá)及鈣離子內(nèi)流效應(yīng)

14、的影響
　　RT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.7組

15、相比，維拉帕米干預(yù)組LTCCβ3亞基表達(dá)水平降低(P<0.05)。熒光顯色結(jié)果顯示，間歇性堿刺激增加VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度(P<0.05)，維拉帕米抑制減少VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度(P<0.05)。
　　6.間歇性堿刺激對高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)LTCCβ3亞基表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示，與正常對照組相比，高磷+pH7.4組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.4組相比，高磷+pH7.5組LTCC

16、β3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.5組相比，高磷+pH7.6組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.6組相比，高磷+pH7.7組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P<0.05)；與高磷+pH7.7組相比，維拉帕米干預(yù)組LTCCβ3亞基表達(dá)水平降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：間歇性堿刺激促進(jìn)高磷誘導(dǎo)的VSMCs的血管鈣化，其機(jī)制可能與間歇性堿刺激上調(diào)L型鈣通道β3亞基表達(dá)，進(jìn)而增加鈣離子內(nèi)流