高鎂通過L型鈣通道調(diào)控高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細胞鈣化發(fā)生的研究.pdf

1、目的：慢性腎臟?。–hronic Kidney disease, CKD）的發(fā)病率逐年升高，目前已成為一個世界性的問題，研究表明心血管疾?。–ardiovascular Disease, CVD)是CKD患者死亡的首位原因，其中血管鈣化是心血管疾?。–ardiovascular Disease, CVD)發(fā)病的獨立危險因素。血管中膜鈣化是CKD患者血管鈣化的主要特點。血管平滑肌細胞（Vascular Smooth Muscle Cell

2、s, VSMCs）是血管中膜的重要組成部分，研究發(fā)現(xiàn)，鎂可以抑制血管中膜鈣化，但其具體機制及其復(fù)雜，目前尚不明確。本研究主要探討高鎂對慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響及可能機制。
　　方法：
　　1.大鼠 VSMCs的原代培養(yǎng)及實驗分組
　　貼壁法原代細胞培養(yǎng)，3~4代細胞供實驗用，將細胞隨機分為A、正常對照組；B、高磷組（10mmol/Lβ-GP）；C、高鎂組（10mmol/Lβ-GP+3mmol/L MgSO4）D、鎂

3、通道抑制劑（2-APB）干預(yù)組（10mmol/Lβ-GP+3mmol/L MgSO4+10-4mol/L2-APB）。各組VSMCs培養(yǎng)7天。
　　2.血管環(huán)的制備及分組
　　1只SD雄性大鼠220-250 g，取其胸主動脈，去除內(nèi)、外膜后，并將血管切成約2mm-3mm長的血管環(huán)進行培養(yǎng)，血管環(huán)被隨機分為4組：a、正常對照組；b、高磷組；c、高鎂組：d、鎂通道抑制劑干預(yù)組。各組培養(yǎng)基同細胞培養(yǎng)。各組血管環(huán)培養(yǎng)7天。
　

4、　3.培養(yǎng)7天后測定各組VSMCs和血管環(huán)的鈣化水平
　　各組VSMCs的鈣化染色應(yīng)用茜素紅(Alizarin red stain)法，血管化的鈣化染色應(yīng)用 Von Kossa染色法；應(yīng)用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測定各組VSMCs和血管環(huán)的鈣含量。
　　4.培養(yǎng)7天后各組VSMCs的堿性磷酸酶（ALP）活性測定
　　各組細胞培養(yǎng)7天后棄上清，應(yīng)用PBS洗3次，加入0.1％Triton X-100置于4℃環(huán)境中過夜，并依據(jù)

5、ALP活性試劑盒說明測定其活性，每組實驗均重復(fù)3次。
　　5.反轉(zhuǎn)錄-PCR、Western Blot檢測各組VSMCs中RUNX2基因及蛋白的表達
　　應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-PCR方法檢測培養(yǎng)7天后各組VSMCs RUNX2基因的表達。應(yīng)用Western Blot方法檢測各組VSMCs培養(yǎng)7天后RUNX2蛋白的表達。
　　6.免疫組織化學(xué)法檢測血管環(huán)Runx2表達
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測各組血管環(huán)培養(yǎng)7天后RUNX

6、2的表達。
　　7.反轉(zhuǎn)錄-PCR、Western Blot檢測各組VSMCs中目的基因及蛋白的表達
　　應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-PCR方法檢測培養(yǎng)7天后各組VSMCs LTCCα1c、β3基因的表達。應(yīng)用Western Blot檢測培養(yǎng)7天后各組VSMCs LTCCα1c、β3蛋白的表達。
　　8.培養(yǎng)7天后各組VSMCs內(nèi)鈣離子濃度測定
　　培養(yǎng)7天后各組VSMCs內(nèi)鈣離子濃度應(yīng)用熒光探針Fluo-3/AM方法檢測。

7、r>　　9.統(tǒng)計學(xué)方法
　　應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用S-N-K檢驗（Student-Newman-Keuls，SNK）。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs和血管環(huán)鈣化
　　茜素紅染色結(jié)果示，與正常對照組相比，高磷組可見大量橘紅色鈣鹽沉積；而

8、與高磷組相比，高鎂組VSMCs鈣鹽沉積顯著減少，鎂通道抑制劑干預(yù)組VSMCs鈣鹽沉積較鎂干預(yù)組明顯增加。與茜素紅染色相一致，鈣含量測定結(jié)果顯示高磷誘導(dǎo)的鈣鹽沉積可被鎂干預(yù)組明顯降低(P<0.05)，而2-APB可抑制這種作用（P<0.05)。
　　各組血管環(huán)Von Kossa染色結(jié)果示：與正常對照組相比，高磷組血管環(huán)中膜可見大量棕黑色顆粒沉積，高鎂可明顯減少棕黑色顆粒的沉積。鈣含量測定結(jié)果與血管環(huán)Von Kossa染色結(jié)果一致示：

9、與正常對照組相比，高磷組血管環(huán)的鈣含量明顯升高(P<0.05)，而高鎂組血管環(huán)鈣含量明顯低于高磷組(P<0.05)。
　　2.高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs ALP活性
　　各組 VSMCs ALP活性測定結(jié)果示：高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組ALP活性明顯高于高鎂組（P<0.05)。
　　3.高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs RUNX2的表達情況反轉(zhuǎn)錄-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，各組VSMCs培養(yǎng)7天后，較高鎂

10、組RUNX2表達水平相比，高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組明顯增加(P<0.05)。
　　4.高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)RUNX2的表達
　　各組血管環(huán)培養(yǎng)給予不同干預(yù)7天后，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果示，高磷組血管細胞質(zhì)內(nèi)外可見棕黃色物質(zhì)沉積，明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高磷組相比，高鎂組血管細胞質(zhì)內(nèi)外棕黃色物質(zhì)變淡，著色區(qū)域面積明顯減少，Runx2表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與高鎂組相比

11、，鎂通道抑制劑干預(yù)組血管細胞質(zhì)內(nèi)外棕黃色物質(zhì)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs LTCCα1c、β3的表達
　　反轉(zhuǎn)錄-PCR和 Western Blot結(jié)果示，各組VSMCs培養(yǎng)7天后，高鎂組 LTCCα1c、β3的表達水平明顯低于高磷組及鎂通道抑制劑干預(yù)組(P<0.05)。
　　6.高鎂抑制高磷誘導(dǎo)的VSMCs胞外鈣離子內(nèi)流效應(yīng)
　　各組VSMCs Fluoβ3/A