高鎂通過L型鈣通道調控高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化發(fā)生的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:慢性腎臟病(Chronic Kidney disease, CKD)的發(fā)病率逐年升高,目前已成為一個世界性的問題,研究表明心血管疾?。–ardiovascular Disease, CVD)是CKD患者死亡的首位原因,其中血管鈣化是心血管疾?。–ardiovascular Disease, CVD)發(fā)病的獨立危險因素。血管中膜鈣化是CKD患者血管鈣化的主要特點。血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cell

2、s, VSMCs)是血管中膜的重要組成部分,研究發(fā)現,鎂可以抑制血管中膜鈣化,但其具體機制及其復雜,目前尚不明確。本研究主要探討高鎂對慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響及可能機制。
  方法:
  1.大鼠 VSMCs的原代培養(yǎng)及實驗分組
  貼壁法原代細胞培養(yǎng),3~4代細胞供實驗用,將細胞隨機分為A、正常對照組;B、高磷組(10mmol/Lβ-GP);C、高鎂組(10mmol/Lβ-GP+3mmol/L MgSO4)D、鎂

3、通道抑制劑(2-APB)干預組(10mmol/Lβ-GP+3mmol/L MgSO4+10-4mol/L2-APB)。各組VSMCs培養(yǎng)7天。
  2.血管環(huán)的制備及分組
  1只SD雄性大鼠220-250 g,取其胸主動脈,去除內、外膜后,并將血管切成約2mm-3mm長的血管環(huán)進行培養(yǎng),血管環(huán)被隨機分為4組:a、正常對照組;b、高磷組;c、高鎂組:d、鎂通道抑制劑干預組。各組培養(yǎng)基同細胞培養(yǎng)。各組血管環(huán)培養(yǎng)7天。
 

4、 3.培養(yǎng)7天后測定各組VSMCs和血管環(huán)的鈣化水平
  各組VSMCs的鈣化染色應用茜素紅(Alizarin red stain)法,血管化的鈣化染色應用 Von Kossa染色法;應用鄰甲酚酞絡合酮比色法測定各組VSMCs和血管環(huán)的鈣含量。
  4.培養(yǎng)7天后各組VSMCs的堿性磷酸酶(ALP)活性測定
  各組細胞培養(yǎng)7天后棄上清,應用PBS洗3次,加入0.1%Triton X-100置于4℃環(huán)境中過夜,并依據

5、ALP活性試劑盒說明測定其活性,每組實驗均重復3次。
  5.反轉錄-PCR、Western Blot檢測各組VSMCs中RUNX2基因及蛋白的表達
  應用反轉錄-PCR方法檢測培養(yǎng)7天后各組VSMCs RUNX2基因的表達。應用Western Blot方法檢測各組VSMCs培養(yǎng)7天后RUNX2蛋白的表達。
  6.免疫組織化學法檢測血管環(huán)Runx2表達
  應用免疫組織化學方法檢測各組血管環(huán)培養(yǎng)7天后RUNX

6、2的表達。
  7.反轉錄-PCR、Western Blot檢測各組VSMCs中目的基因及蛋白的表達
  應用反轉錄-PCR方法檢測培養(yǎng)7天后各組VSMCs LTCCα1c、β3基因的表達。應用Western Blot檢測培養(yǎng)7天后各組VSMCs LTCCα1c、β3蛋白的表達。
  8.培養(yǎng)7天后各組VSMCs內鈣離子濃度測定
  培養(yǎng)7天后各組VSMCs內鈣離子濃度應用熒光探針Fluo-3/AM方法檢測。

7、r>  9.統(tǒng)計學方法
  應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理,符合正態(tài)分布的計量資料用均數±標準差(-x±s)表示,多個樣本均數比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較用S-N-K檢驗(Student-Newman-Keuls,SNK)。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
  結果:
  1.高鎂抑制高磷誘導的VSMCs和血管環(huán)鈣化
  茜素紅染色結果示,與正常對照組相比,高磷組可見大量橘紅色鈣鹽沉積;而

8、與高磷組相比,高鎂組VSMCs鈣鹽沉積顯著減少,鎂通道抑制劑干預組VSMCs鈣鹽沉積較鎂干預組明顯增加。與茜素紅染色相一致,鈣含量測定結果顯示高磷誘導的鈣鹽沉積可被鎂干預組明顯降低(P<0.05),而2-APB可抑制這種作用(P<0.05)。
  各組血管環(huán)Von Kossa染色結果示:與正常對照組相比,高磷組血管環(huán)中膜可見大量棕黑色顆粒沉積,高鎂可明顯減少棕黑色顆粒的沉積。鈣含量測定結果與血管環(huán)Von Kossa染色結果一致示:

9、與正常對照組相比,高磷組血管環(huán)的鈣含量明顯升高(P<0.05),而高鎂組血管環(huán)鈣含量明顯低于高磷組(P<0.05)。
  2.高鎂抑制高磷誘導的VSMCs ALP活性
  各組 VSMCs ALP活性測定結果示:高磷組及鎂通道抑制劑干預組ALP活性明顯高于高鎂組(P<0.05)。
  3.高鎂抑制高磷誘導的VSMCs RUNX2的表達情況反轉錄-PCR和Western Blot結果顯示,各組VSMCs培養(yǎng)7天后,較高鎂

10、組RUNX2表達水平相比,高磷組及鎂通道抑制劑干預組明顯增加(P<0.05)。
  4.高鎂抑制高磷誘導的血管環(huán)RUNX2的表達
  各組血管環(huán)培養(yǎng)給予不同干預7天后,免疫組織化學檢測結果示,高磷組血管細胞質內外可見棕黃色物質沉積,明顯高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與高磷組相比,高鎂組血管細胞質內外棕黃色物質變淡,著色區(qū)域面積明顯減少,Runx2表達明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與高鎂組相比

11、,鎂通道抑制劑干預組血管細胞質內外棕黃色物質增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
  5.高鎂抑制高磷誘導的VSMCs LTCCα1c、β3的表達
  反轉錄-PCR和 Western Blot結果示,各組VSMCs培養(yǎng)7天后,高鎂組 LTCCα1c、β3的表達水平明顯低于高磷組及鎂通道抑制劑干預組(P<0.05)。
  6.高鎂抑制高磷誘導的VSMCs胞外鈣離子內流效應
  各組VSMCs Fluoβ3/A

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