核心結合因子α1 siRNA靶向抑制對高磷誘導的血管平滑肌細胞鈣化的影響.pdf

1、【目的】
　　本課題利用小分子干擾RNA(siRNA)靶向抑制血管平滑肌細胞(VSMC)中Cbfα-1基因表達,觀察Cbfα-1表達抑制對高磷誘導的VSMC成骨樣轉分化及鈣鹽沉積的影響,從而探討Cbfα-1在高磷誘導的VSMC鈣化中的作用,試圖進一步闡明CKD血管鈣化的可能機制,并為治療提供可能的靶點。
　　【方法】
　　1.組織塊貼壁法原代培養(yǎng)VSMC,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及α-SMA免疫組化鑒定;3~8代VS

2、MC用于實驗。
　　2.針對大鼠Cbfα-1基因設計合成4對候選siRNA序列,以陽離子脂質體為載體,轉染體外培養(yǎng)的VSMC細胞;FAM熒光標記siRNA測定轉染效率并優(yōu)化轉染條件。RT-PCR法分析4對候選siRNA序列對Cbfα-1基因表達的抑制作用,篩選出有效siRNA序列。
　　3.將篩選出的有效siRNA序列轉染VSMC,細胞分為4組:(1)正常磷(1.3mmol/L)組;(2)高磷(2.6mmol/L)組;(3)

3、siRNA轉染組:高磷(2.6mmol/L)+轉染試劑+Cbfα-1-siRNA(有效siRNA序列);(4)陰性轉染對照組:高磷(2.6mmol/L)+轉染試劑+陰性對照siRNA,轉染后24h、48h通過RT-PCR技術檢測成骨樣轉分化相關基因Cbfα-1、骨橋蛋白(OPN)mRNA表達情況;轉染后48、72h采用WesternBlot方法檢測Cbfα-1、OPN蛋白表達情況;轉染后第6天通過茜素紅染色法檢測細胞鈣鹽沉積情況。所有實

4、驗至少重復3次。
　　【結果】
　　1.細胞鑒定:雙目倒置相差顯微鏡下,大鼠VSMC為梭形細胞,呈典型的“峰-谷”樣生長?？功?SMA抗體免疫組織化學染色顯示,VSMC胞漿內見大量棕色顆粒。
　　2.熒光顯微鏡下觀察顯示,在Cbfα-1-siRNA濃度為100nmol/L、Lipo為8μL/孔轉染條件下,轉染效率約55％;RT-PCR結果顯示Cbfα-1siRNA1952序列相對基因抑制水平最強,轉染24h以后沉默效率

5、達81.77%,故作為有效siRNA序列。
　　3.RT-PCR結果顯示,轉染后24h,與正常磷組相比,高磷組VSMC中Cbfα-1及OPNmRNA表達明顯增加(P<0.01),與高磷組及陰性轉染對照組相比,siRNA轉染組Cbfα-1mRNA表達明顯降低(P<0.01),而三組間OPNmRNA表達無明顯差異(P>0.05);轉染后48h,siRNA轉染組Cbfα-1mRNA表達仍低于高磷組及陰性轉染對照組(P<0.05),但高于

6、正常磷組(P<0.05),OPNmRNA表達低于高磷組及陰性轉染對照組(P<0.05),但高于正常磷組(P<0.05)。
　　4.WesternBlot結果顯示,轉染后48h,與正常磷組相比,高磷組Cbfα-1及OPN蛋白表達明顯增加(P<0.01),siRNA轉染組Cbfα-1蛋白表達較高磷組及陰性轉染對照組明顯降低(P<0.01),三組間OPN蛋白表達無明顯差異(P>0.05);轉染后72h,siRNA轉染組Cbfα-1蛋白表

7、達仍低于高磷組及陰性轉染對照組(P<0.05),但高于正常磷組(P<0.05),OPN蛋白表達低于高磷組及陰性轉染對照組(P<0.05),但高于正常磷組(P<0.05)。
　　5.茜素紅染色結果顯示,正常磷組細胞無明顯鈣鹽沉積,高磷組和陰性轉染對照組細胞鈣鹽沉積明顯,而siRNA轉染組細胞鈣鹽沉積明顯減輕。
　　【結論】
　　1.高磷條件可在體外成功誘導大鼠VSMC鈣化。化學合成的Cbfα-1siRNA通過脂質體瞬時轉