核心結(jié)合因子α1 siRNA靶向抑制對高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響.pdf

1、【目的】
　　本課題利用小分子干擾RNA(siRNA)靶向抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中Cbfα-1基因表達(dá),觀察Cbfα-1表達(dá)抑制對高磷誘導(dǎo)的VSMC成骨樣轉(zhuǎn)分化及鈣鹽沉積的影響,從而探討Cbfα-1在高磷誘導(dǎo)的VSMC鈣化中的作用,試圖進(jìn)一步闡明CKD血管鈣化的可能機(jī)制,并為治療提供可能的靶點(diǎn)。
　　【方法】
　　1.組織塊貼壁法原代培養(yǎng)VSMC,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及α-SMA免疫組化鑒定;3~8代VS

2、MC用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.針對大鼠Cbfα-1基因設(shè)計(jì)合成4對候選siRNA序列,以陽離子脂質(zhì)體為載體,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的VSMC細(xì)胞;FAM熒光標(biāo)記siRNA測定轉(zhuǎn)染效率并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。RT-PCR法分析4對候選siRNA序列對Cbfα-1基因表達(dá)的抑制作用,篩選出有效siRNA序列。
　　3.將篩選出的有效siRNA序列轉(zhuǎn)染VSMC,細(xì)胞分為4組:(1)正常磷(1.3mmol/L)組;(2)高磷(2.6mmol/L)組;(3)

3、siRNA轉(zhuǎn)染組:高磷(2.6mmol/L)+轉(zhuǎn)染試劑+Cbfα-1-siRNA(有效siRNA序列);(4)陰性轉(zhuǎn)染對照組:高磷(2.6mmol/L)+轉(zhuǎn)染試劑+陰性對照siRNA,轉(zhuǎn)染后24h、48h通過RT-PCR技術(shù)檢測成骨樣轉(zhuǎn)分化相關(guān)基因Cbfα-1、骨橋蛋白(OPN)mRNA表達(dá)情況;轉(zhuǎn)染后48、72h采用WesternBlot方法檢測Cbfα-1、OPN蛋白表達(dá)情況;轉(zhuǎn)染后第6天通過茜素紅染色法檢測細(xì)胞鈣鹽沉積情況。所有實(shí)

4、驗(yàn)至少重復(fù)3次。
　　【結(jié)果】
　　1.細(xì)胞鑒定:雙目倒置相差顯微鏡下,大鼠VSMC為梭形細(xì)胞,呈典型的“峰-谷”樣生長?？功?SMA抗體免疫組織化學(xué)染色顯示,VSMC胞漿內(nèi)見大量棕色顆粒。
　　2.熒光顯微鏡下觀察顯示,在Cbfα-1-siRNA濃度為100nmol/L、Lipo為8μL/孔轉(zhuǎn)染條件下,轉(zhuǎn)染效率約55％;RT-PCR結(jié)果顯示Cbfα-1siRNA1952序列相對基因抑制水平最強(qiáng),轉(zhuǎn)染24h以后沉默效率

5、達(dá)81.77%,故作為有效siRNA序列。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后24h,與正常磷組相比,高磷組VSMC中Cbfα-1及OPNmRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01),與高磷組及陰性轉(zhuǎn)染對照組相比,siRNA轉(zhuǎn)染組Cbfα-1mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01),而三組間OPNmRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05);轉(zhuǎn)染后48h,siRNA轉(zhuǎn)染組Cbfα-1mRNA表達(dá)仍低于高磷組及陰性轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05),但高于

6、正常磷組(P<0.05),OPNmRNA表達(dá)低于高磷組及陰性轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05),但高于正常磷組(P<0.05)。
　　4.WesternBlot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后48h,與正常磷組相比,高磷組Cbfα-1及OPN蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01),siRNA轉(zhuǎn)染組Cbfα-1蛋白表達(dá)較高磷組及陰性轉(zhuǎn)染對照組明顯降低(P<0.01),三組間OPN蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05);轉(zhuǎn)染后72h,siRNA轉(zhuǎn)染組Cbfα-1蛋白表

7、達(dá)仍低于高磷組及陰性轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05),但高于正常磷組(P<0.05),OPN蛋白表達(dá)低于高磷組及陰性轉(zhuǎn)染對照組(P<0.05),但高于正常磷組(P<0.05)。
　　5.茜素紅染色結(jié)果顯示,正常磷組細(xì)胞無明顯鈣鹽沉積,高磷組和陰性轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞鈣鹽沉積明顯,而siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞鈣鹽沉積明顯減輕。
　　【結(jié)論】
　　1.高磷條件可在體外成功誘導(dǎo)大鼠VSMC鈣化?；瘜W(xué)合成的Cbfα-1siRNA通過脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)