T3對鈣磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本文擬通過鈣化模型在細(xì)胞水平研究三碘甲腺原氨酸(3，5，3'-Triiodothyronine，T3)在血管鈣化及血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化時相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的變化和作用，并進(jìn)一步明確T3調(diào)節(jié)血管鈣化及VSMCs向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的主要信導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而論證T3是抑制血管鈣化的重要內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，為臨床調(diào)節(jié)和逆轉(zhuǎn)血管鈣化所致的動脈高壓相關(guān)疾病提供有效的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　體

2、外培養(yǎng)大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞A7r5，將細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、鈣化模型組（加入β-甘油磷酸鹽和氯化鈣培養(yǎng)基）、T3干預(yù)組（在鈣磷培養(yǎng)基中加入T3，根據(jù)濃度再分為10-7、10-8、10-9mol/L三個亞組）和抑制劑干預(yù)組，對細(xì)胞采用茜素紅染色檢測鈣化結(jié)節(jié)，細(xì)胞骨鈣素含量測定，ALP活性檢測，RT-PCR檢測Runx2和Osterix的mRNA含量，Western blot檢測骨化指標(biāo)OPN、SM22α-actin和SMα-actin

3、及信號通路調(diào)節(jié)蛋白ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt的表達(dá)水平，加入信號通路抑制劑后再次檢測Runx2和Osterix的mRNA含量以及OPN、SM22α-actin和SMα-actin的蛋白含量。
　　結(jié)果：
　　與正常對照組相比，鈣化組A7r5細(xì)胞的骨鈣素含量、ALP活性、Osterix和Runx2mRNA水平、OPN蛋白水平均顯著升高(P＜0.01)，SMα和SM22α蛋白水平顯著下降（P＜0.01）;加入T

4、3干預(yù)后細(xì)胞骨鈣素含量、ALP活性明顯降低，Osterix和Runx2mRNA、OPN蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而加入MMI后可阻斷以上T3的抑制效果;與鈣化組相比，抑制劑組Osterix和Runx2mRNA、OPN蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。鈣化組可檢測到信號通路調(diào)節(jié)蛋白ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt的表達(dá)增加，加入整合素αvβ3/ERK阻斷劑(PD98059)、PI3K/Akt拮抗劑(LY294002)后，再用T3進(jìn)行干

5、預(yù)，抑制鈣化的效果依然存在，但與單純加抑制劑組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，兩組間比較提示LY294002的抑制效果較PD98059明顯(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、鈣磷培養(yǎng)液誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞12天可成功構(gòu)建鈣化細(xì)胞模型。
　　2、T3可降低A7r5鈣化細(xì)胞的鈣沉積及堿性磷酸酶活性，此效應(yīng)呈濃度依賴性，說明T3是調(diào)節(jié)血管鈣化的內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)。
　　3、T3上調(diào)平滑肌細(xì)胞標(biāo)志分子SM22α和SMα，使骨相關(guān)蛋白OPN

6、的表達(dá)增加，同時檢測到骨分化的重要轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix的mRNA水平下降，而加入T3拮抗劑MMI后，上述T3抑制鈣化的效果被部分拮抗，說明T3通過抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)來調(diào)節(jié)血管鈣化。
　　4、鈣磷誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞鈣化過程中可檢測到信號通路調(diào)節(jié)蛋白ERK1/2、Akt的活化，加入相應(yīng)的抑制劑后表型轉(zhuǎn)化特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix和Runx2mRNA的表達(dá)均有所下調(diào)，隨著抑制劑濃度的升高骨分化蛋白OPN