白藜蘆醇抑制AGEs誘導泡沫細胞形成及血管平滑肌細胞鈣化的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 目前糖尿病(DM)發(fā)病率呈明顯的逐年增高趨勢,DM患者發(fā)生動脈粥樣硬化(AS)及危及生命的心血管并發(fā)癥較正常人顯著增加。另外,糖尿病的大血管鈣化包括主動脈、腎動脈、周圍血管等的鈣化是導致腎動脈狹窄和周圍血管閉塞性疾病甚至致殘的重要原因。因此,深入研究糖尿病性血管病變的發(fā)生機制,尋找重要靶點和開發(fā)新的藥物具有重要意義。
　　 持久的高血糖狀態(tài)可導致DM患者體內(nèi)蓄積過多的糖基化終產(chǎn)物(advancedgly

2、cation end products,AGEs),后者與細胞表面的AGEs受體(Receptor for AGEs,RAGE)相互作用而發(fā)揮一系列的血管病理作用,加速糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。膽固醇酯的沉積和巨噬細胞源性的泡沫細胞形成是AS發(fā)生的早期事件和關(guān)鍵環(huán)節(jié),而AGEs-RAGE對哪些脂質(zhì)受體或脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白有調(diào)節(jié)作用,研究結(jié)果仍不一致。同時,臨床資料提示,老齡、糖尿病、高血壓和鈣超載是動脈鈣化的主要危險因素。近來發(fā)現(xiàn),AGEs

3、可促進血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的鈣化,但其具體機制仍未完全明確。尋找阻斷AGEs血管損害作用的藥物并探索其機制具有重要的臨床意義。
　　 白藜蘆醇(resveratrol,RESV)是一種非黃酮類多酚化合物,具有保護心血管、抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化和模擬雌激素等廣泛作用,對改善胰島素敏感性、防治糖尿病和改善內(nèi)皮損傷、預防心血管重構(gòu)等具有顯著效果。然而,白藜蘆醇對糖尿病動脈粥

4、樣斑塊中巨噬細胞源性泡沫細胞的形成有何影響尚不明確,同時白藜蘆醇對糖尿病條件下血管平滑肌細胞的鈣化有何影響尚未見報道。
　　 由于PPARγ在巨噬細胞脂質(zhì)代謝過程中具有調(diào)節(jié)作用,而白藜蘆醇可激活PPARγ,因此我們推測,白藜蘆醇可能通過激活PPARγ抑制AGEs誘導的泡沫細胞形成。此外,由于VSMC鈣化和骨細胞分化過程相似,而白藜蘆醇可以影響骨細胞分化,我們推測白藜蘆醇對AGEs作用下的VSMC鈣化也有一定程度的作用。
　

5、　 材料方法
　　 為了證實該推測,本研究將分為體外細胞實驗和在體動物實驗兩部分。
　　 第一部分以人單核細胞系THP-1源性的巨噬細胞為模型,通過檢測細胞脂質(zhì)攝取和轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達以及細胞內(nèi)脂質(zhì)含量,研究AGEs聯(lián)合或不聯(lián)合白藜蘆醇對氧化型LDL(ox-LDL)誘導的泡沫細胞形成的影響。第二部分以原代培養(yǎng)的小鼠VSMC為模型,給予適當?shù)臈l件誘導其向成骨細胞分化,檢測相關(guān)信號通路和成骨信號分子的表達以及細胞鈣含量,觀

6、察AGEs聯(lián)合或不聯(lián)合白藜蘆醇對VSMC鈣化的影響。第三部分以apoE基因敲除型小鼠為模型,給予STZ和高脂飲食聯(lián)合誘導糖尿病動脈粥樣硬化模型,給予含白藜蘆醇的飼料進行干預,觀察其對動物主動脈粥樣斑塊和鈣化的影響。
　　 試驗步驟如下:
　　 1.在經(jīng)PMA誘導的THP-1源性巨噬細胞中加入不同濃度AGEs,以及在固定濃度AGEs作用下加入不同濃度的白藜蘆醇,通過免疫印跡檢測RAGE的表達變化;
　　 2.通過免

7、疫印跡檢測白藜蘆醇作用下PPAR丫等分子的表達,以及加入PPARγ拮抗劑GW9662后白藜蘆醇對RAGE表達的影響;
　　 3.在AGEs和白藜蘆醇作用下的巨噬細胞細胞中,檢測加入或不加GW9662時CD36、SR-A、ABCA1及ABCG1等相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運基因的表達情況;
　　 4.通過細胞內(nèi)總膽固醇定量和油紅O染色,檢測AGEs、AGEs+白藜蘆醇以及AGEs+白藜蘆醇+GW9662分別對細胞內(nèi)膽固醇含量和脂滴形成的影

8、響;
　　 5.通過定量PCR檢測不同濃度白藜蘆醇對VSMC鈣化過程中cbfa1、sm22a和ALP的表達以及細胞鈣含量的影響;
　　 6.通過免疫印跡明確白藜蘆醇對VSMC中RAGE表達及ERK1/2磷酸化的影響;
　　 7.利用定量PCR和免疫印跡檢測白藜蘆醇、RAGE中和抗體、ERK1/2阻斷劑分
　　 別對VSMC中cbfal和sm22a表達的影響;
　　 8.建立糖尿病動脈粥樣硬化小鼠模

9、型,予以白藜蘆醇干預20周后測定小鼠體重、血糖、血脂等指標;
　　 9.免疫印跡檢測各組小鼠主動脈中RAGE、cbfa1、sm22a的表達情況,驗證白藜蘆醇對糖尿病小鼠粥樣斑塊形成和動脈鈣化的影響;
　　 10.通過動脈冰凍切片油紅O和茜素紅染色,觀察各組小鼠主動脈粥樣硬化和鈣化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.AGEs顯著上調(diào)巨噬細胞RAGE的表達,而白藜蘆醇可以抑制AGEs誘導的RAGE表達上調(diào);PPA

10、Rγ拮抗劑GW9662可以減弱白藜蘆醇對RAGE的抑制作用;
　　 2.AGEs可以上調(diào)SR-A的表達,降低ABCA1和ABCG1的表達,而白藜蘆醇能夠抑制AGEs引起的基因表達變化,但白藜蘆醇的作用可被GW9662阻斷;
　　 3.AGEs顯著升高巨噬細胞中總膽固醇含量,促進脂滴形成;白藜蘆醇能顯著抑制AGEs引起的脂質(zhì)蓄積,GW9662可以阻斷白藜蘆醇的效應;
　　 4.在VSMC中,白藜蘆醇顯著抑制AGEs

11、誘導的cbfal表達上調(diào)、細胞內(nèi)ALP和鈣含量增加,同時抑制AGEs引起的sm22a的表達降低;
　　 5.AGEs上調(diào)vSMC中RAGE的表達,促進ERK1/2磷酸化,而白藜蘆醇可以抑制AGEs的作用;
　　 6.加入RAGE中和抗體和ERK1/2抑制劑后,同樣可以抑制AGEs誘導的cbfal表達上調(diào)和sm22a表達下降,提示RAGE和ERK1/2介導了白藜蘆醇的生物學效應;
　　 7.白藜蘆醇可以降低糖尿病小

12、鼠血漿中總膽固醇、甘油三酯及LDL-C含量,升高HDL-C水平,從而部分恢復糖尿病引起的脂質(zhì)代謝紊亂;
　　 8.白藜蘆醇可以抑制糖尿病小鼠主動脈中RAGE、cbfal的表達,上調(diào)PPARγ和sm22a的表達;同時白藜蘆醇可以抑制糖尿病小鼠主動脈中粥樣硬化斑塊和動脈鈣化斑塊形成。
　　 結(jié)論：
　　 1.白藜蘆醇通過激活PPARγ抑制RAGE表達,調(diào)控SR-A、ABCA1和ABCG1等脂質(zhì)轉(zhuǎn)運基因,減輕AGEs誘