干擾素γ對高磷誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響研究.pdf

1、目的:慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)患者心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)發(fā)病率及死亡率較普通人群明顯升高，其主要原因可能是CVD構(gòu)成了慢性腎臟病患者死亡的主要危險(xiǎn)因素，約占總其死亡率的50％以上，更有研究表明，心血管事件中，冠狀動脈鈣化約占20％。而與傳統(tǒng)的冠脈鈣化不同，CKD患者的血管鈣化主要發(fā)生在中膜，主要由血管平滑肌構(gòu)成，目前已有大量研究表明，隨著CKD患者腎功

2、能喪失，對磷清除減少，進(jìn)而血清磷升高，促進(jìn)了CKD血管鈣化，血清磷是促進(jìn)CKD患者血管鈣化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。大量基礎(chǔ)研究表明，高磷環(huán)境促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型向成骨/成軟骨樣轉(zhuǎn)化、促使核心結(jié)合因子α1（Cbfα1）、骨形成蛋白BMP-2表達(dá)上調(diào)而誘導(dǎo)鈣化，高磷誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，同時(shí)還涉及凋亡等其他多種因素，其具體機(jī)制目前仍未明確。而目前現(xiàn)

3、實(shí)中對血管鈣化的預(yù)防與治療方面尚無行之有效的方法及措施。研究顯示干擾素γ對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生成有一定的調(diào)節(jié)作用，而VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的過程恰恰與此過程相似。本研究旨在研究高磷誘導(dǎo)血管鈣化的基礎(chǔ)上增加干擾素γ，觀察干擾素γ能否抑制或減輕血管鈣化程度。
　　方法:
　　1、采取大鼠主動脈組織塊貼壁法原代培養(yǎng)并獲取VSMCs，并應(yīng)用形態(tài)學(xué)及細(xì)胞免疫學(xué)的方法對VSMCs進(jìn)行鑒定。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)處理:將VSMC

4、s應(yīng)用隨機(jī)分組方法分為陰性對照組、高磷組及干擾素γ干預(yù)組，陰性對照組采用低糖的DMEM加10％胎牛血清作為正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，高磷組是在正常培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入濃度為10 mmol/Lβ-甘油磷酸配制成的高磷培養(yǎng)基培養(yǎng)，干擾素γ干預(yù)組在上述高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入干擾素γ，使干擾素γ的最終濃度為100u/mL，各組共刺激VSMCs共3d。
　　3、鈣化檢測:各組VSMCs培養(yǎng)14d后分別用茜素紅(Alizarin red stain)

5、鈣化染色和比色法測定細(xì)胞的鈣含量。
　　4、堿性磷酸酶(ALP)活性測定:取3～4代細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度大約為2×105/孔，干預(yù)時(shí)間為7d，棄去培養(yǎng)基，PBS液洗滌細(xì)胞2-3次，每孔加入500μL0.1％TritonⅩ～100置于4℃環(huán)境中約12～24 h，然后反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，并置于離心管中離心，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測ALP的活性。
　　5、采用RT-PCR方法研究高磷、干擾素γ干預(yù)組對VSMCs中Cbfα1、BMP-

6、2、Smad1、Smad7 mRNA水平表達(dá)的影響。
　　6、蛋白印跡法檢測:取干預(yù)3d的各組細(xì)胞，按照常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗(B-actin1∶1000，Cbfα11∶500)稀釋液，4℃孵育過夜。洗膜3次后加入熒光二抗稀釋液(1∶2000)，室溫下孵育2h，用免疫熒光成像系統(tǒng)顯色，應(yīng)用圖像分析軟件對條帶進(jìn)行掃描并測得灰度值，

7、計(jì)算蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)表示，用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較，用S-N-K檢驗(yàn)(student-Newman-Keuls，SNK)作多組間均數(shù)兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

8、　結(jié)果:
　　1、VSMCs原代培養(yǎng):采用組織塊貼壁法獲取原代SD大鼠VSMCs，正常情況下組織塊開始貼壁約3-4d后即可見少量細(xì)胞沿組織邊緣爬出，形狀呈長梭形，分散束狀排列，細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間延長而逐漸增多，約培養(yǎng)6-7 d后細(xì)胞可長滿瓶底面積的70％左右。細(xì)胞數(shù)量約占瓶底面積80-90％即可傳代，傳代后由于胰酶的消化作用，細(xì)胞起初并未貼壁，而是呈現(xiàn)圓形或橢圓形漂浮于瓶底，逐漸貼壁后右可恢復(fù)成長梭形，胞漿飽滿豐富，胞核為卵圓形或橢

9、圓形，可見細(xì)胞交互生長，鏡下可見典型的“峰-谷”現(xiàn)象。用免疫細(xì)胞化學(xué)法對平滑肌細(xì)胞進(jìn)行特異性抗體檢測，即α-平滑肌肌動蛋白抗體(α-SMA actin)進(jìn)行檢測，胞漿α-SMA actin若出現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)，或見到棕黃色免疫反應(yīng)產(chǎn)物，則可判定為是平滑肌細(xì)胞。
　　2、茜素紅鈣化染色結(jié)果顯示:高磷組、干擾素γ干預(yù)組與陰性對照組相比，2組中VSMCs鈣化染色均有不同程度的加重，而干擾素γ干預(yù)組與高磷組比較，鈣化染色程度呈現(xiàn)顯著降低。

10、　　3、鈣含量檢測結(jié)果顯示:與陰性對照組相比，高磷組及干擾素γ干預(yù)組刺激VSMCs后，鈣含量均顯著增加，干擾素γ干預(yù)組與高磷組相比，鈣含量明顯降低，其各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、ALP活性測定結(jié)果:與陰性對照組相比，高磷組及干擾素γ干預(yù)組VSMCs的ALP水平均有不同程度地升高。干擾素γ干預(yù)組與高磷組比較，干擾素γ干預(yù)組ALP活性降低。
　　5、RT-PCR檢測各組VSMCs中Cbfα1、BMP-

11、2、Smad1、Smad7 mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示:與陰性對照組相比，高磷組及干擾素γ干預(yù)組的VSMCsCbfα1、BMP-2、Smad1mRNA水平均不同程度地增加，而Smad7 mRNA有所下降，干擾素γ干預(yù)組與高磷組比較，Cbfα1 BMP-2、Smad1mRNA水平也有所下降，Smad7 mRNA水平有所上升，各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、本課題采用SD大鼠胸主動脈組織塊貼壁法成功地培養(yǎng)了原代VSM