硫辛酸通過(guò)抑制2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激和mTOR信號(hào)通路發(fā)揮肝臟保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　隨著人們生活水平的提高及不良生活習(xí)慣的增多，2型糖尿病（type2 diabetes mellitus T2DM）已經(jīng)成為臨床常見(jiàn)疾病，其患病率逐年上升，且發(fā)病有明顯年輕化的趨勢(shì)，極大影響人們身體健康，加重社會(huì)負(fù)擔(dān)。由于T2DM的病程較長(zhǎng)，其慢性并發(fā)癥可廣泛累及心、肝、腎、眼、血管、神經(jīng)等，其中糖尿病合并肝損傷的發(fā)病率正逐年提高。糖尿病相關(guān)性肝損傷最常見(jiàn)的表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty li

2、ver disease， NAFLD），其發(fā)病機(jī)理尚未系統(tǒng)闡明，目前認(rèn)為與氧化應(yīng)激（oxidative stress,OS）、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、微循環(huán)異常、糖基化終產(chǎn)物等因素密切相關(guān)，近年來(lái)氧化應(yīng)激和胰島素抵抗日益引起了人們的關(guān)注。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamyein mTOR）是連接多種信號(hào)通路的樞紐，研究證實(shí)，高血糖、高血脂等引起的氧化應(yīng)激可促使mT OR通路過(guò)度激活，mTOR

3、通路的過(guò)度激活可影響胰島素信號(hào)通路，從而加重糖脂代謝紊亂，促進(jìn)糖尿病肝損傷的發(fā)生。硫辛酸（lipoic acio l， LA）在已知天然抗氧化劑中抗氧化效果最強(qiáng)，其不僅可清除體內(nèi)的多種反應(yīng)性氧自由基，而且還能還原人體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，在糖尿病、糖尿病肝損傷的治療中具有廣大的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)制備2型糖尿病大鼠模型，應(yīng)用硫辛酸干預(yù)，實(shí)驗(yàn)?zāi)z測(cè)各組肝臟中mTO R信號(hào)通路的標(biāo)志物mTOR,AMPK磷酸化水平，以探討α-硫辛

4、酸是否在抗氧化應(yīng)激的同時(shí)抑制糖尿病大鼠 mTOR信號(hào)通路激活從而發(fā)揮肝臟起保護(hù)作用。
　　方法：
　　購(gòu)買22只雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠，鼠齡6周，體重為180g±20g。清潔實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，對(duì)22只大鼠應(yīng)用exc el隨機(jī)數(shù)字表法抽取6只作為正常對(duì)照組設(shè)為A組，抽取8只作為單純糖尿病組設(shè)為B組，余下8中作為硫辛酸組設(shè)為C組。對(duì)照組繼續(xù)應(yīng)用普通飼料喂養(yǎng)，單純糖尿病組和硫辛酸組用

5、高糖高脂飼料喂養(yǎng)。單純糖尿病組和硫辛酸組在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)30 mg/kg。實(shí)驗(yàn)第6周末單純糖尿病組和硫辛酸組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose, FBG）大于等于7.8 mmo l/L作為2型糖尿病大鼠模型造模成功。硫辛酸組予以100 mg/kg硫辛酸腹腔注射，每日給藥1次，連續(xù)腹腔注射8周，對(duì)照組、單純糖尿病組均予以等體積生理鹽水腹腔注射。

6、實(shí)驗(yàn)第14周末：1腹主動(dòng)脈取血，測(cè)定 FBG、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gammaglutamyl transpeptidase,γ-GGT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密

7、度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholestero l，HDL-C）等指標(biāo)，離心后取部分上清液，凍存于-80℃冰箱以備測(cè)8-O HdG。2迅速在預(yù)冷的分離盤(pán)中分離并切取約1mm×1mm×2mm大小的肝臟標(biāo)本放入的2.5％戊二醛固定液中固定，并置于冰箱中4℃保存，以備電鏡觀察。3取部分肝臟放于4%多

8、聚甲醛固定，待HE染色觀察肝臟形態(tài)學(xué)變化、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)mTOR通路蛋白表達(dá)，且應(yīng)用 Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件計(jì)算其IOD/Area。4所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理完成。對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。三組數(shù)據(jù)間兩兩比較時(shí)用單因素方差分析，若滿足方差齊性，進(jìn)行LS D檢驗(yàn)，若方差不齊，進(jìn)行T amhane＇s檢驗(yàn)。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、，以P＜0.01為具有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1實(shí)驗(yàn)?zāi)└鹘M大鼠肝重指數(shù)比較
　　糖尿病組和硫辛酸組與正常對(duì)照組相比肝重指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與糖尿病組對(duì)比，硫辛酸組肝重指數(shù)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　2實(shí)驗(yàn)?zāi)└鹘M大鼠胰島素抵抗指數(shù)比較
　　糖尿病組和硫辛酸組與正常對(duì)照組相比，胰島素抵抗明顯升高（P＜0.05）；硫辛酸組與糖尿病相比，胰島素抵抗指數(shù)降低（P＜0.05）。<

10、br>　　3實(shí)驗(yàn)?zāi)└鹘M大鼠生化指標(biāo)比較
　　糖尿病組、硫辛酸組與糖尿病組相比，F(xiàn) BG明顯升高（P＜0.05），硫辛酸組與糖尿病組相比，F(xiàn)BG無(wú)明顯差異（P＞0.05）；糖尿病組與正常對(duì)照組相比，ALT、AS T、γ-GT、TG、TC、LDL-C明顯升高（P＜0.05）， HDL-C明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；硫辛酸組與正常組相比，ALT、AST、γ-GT、TG、LDL-C升高（P＜0.05），HDL-C降低，差異

11、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；硫辛酸組與糖尿病組相比，ALT、AST、γ-GT、TG、TC、LDL-C明顯降低（P＜0.05），HDL-C升高（P＜0.05）。
　　4實(shí)驗(yàn)?zāi)└鹘M8-O HdG變化
　　單純糖尿病組8-OHdG水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；硫辛酸組與正常對(duì)照組相比8-OHdG水平稍升高（P＜0.05）；單純糖尿病組8-OHdG水平明顯高于硫辛酸組（P＜0.05）。
　　5肝臟HE染色
　　H

12、E染色光鏡下可見(jiàn)正常組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)脂肪變性及壞死、炎細(xì)胞侵潤(rùn)；糖尿病組部分肝細(xì)胞發(fā)生了脂肪變性，脂滴以大泡型為主，伴有較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和點(diǎn)狀壞死，還可見(jiàn)到血管周圍炎及匯管區(qū)少量纖維組織增生；硫辛酸組肝細(xì)胞脂肪變性明顯減少，偶見(jiàn)肝細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)小脂肪空泡及炎性灶。
　　6肝臟電鏡觀察
　　電鏡下可見(jiàn)：正常組肝細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核膜規(guī)整光滑，核仁大而園，居于細(xì)胞中央，核周隙無(wú)擴(kuò)張,

13、核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，線粒體形狀正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布規(guī)律，胞質(zhì)內(nèi)幾乎見(jiàn)不到或有極少量的脂滴；糖尿病組：細(xì)胞核膜邊緣不規(guī)則，核仁邊集，核周隙擴(kuò)張、不均，線粒體明顯增生、腫脹，嵴融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不一脂肪滴沉積；硫辛酸組：肝細(xì)胞核形狀大多規(guī)則,核間隙基本正常，肝細(xì)胞脂肪變性較糖尿病組明顯減輕，胞漿內(nèi)脂滴減少,線粒體腫脹明顯好轉(zhuǎn)，線粒體內(nèi)嵴清楚融合不明顯,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)接近正常。
　　7肝臟磷酸化mTOR、AMPK蛋

14、白表達(dá)水平
　　糖尿病組磷酸化mT OR、硫辛酸組磷酸化mTO R表達(dá)水平較正常組明顯增多（P＜0.05）；硫辛酸組磷酸化mTO R表達(dá)水平較糖尿病組明顯減少（P＜0.05）。糖尿病組磷酸化AMP K、硫辛酸組磷酸化AMP K表達(dá)水平較正常組明顯減少（P＜0.05）；硫辛酸組磷酸化AMPK表達(dá)水平較糖尿病組明顯增多（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1糖尿病組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶升高，鏡下觀察肝臟出現(xiàn)組織學(xué)改變，說(shuō)明糖尿病大