α-硫辛酸對氧化應激下人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　 觀察α-硫辛酸(ALA)對外源性H2O2誘導的人視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細胞的氧化損傷是否具有保護作用,并通過細胞凋亡和細胞自噬角度研究α-硫辛酸對氧化應激下ARPE-19細胞的保護作用途徑及其相關(guān)的分子機制。
　　 方法：
　　 1.人視網(wǎng)膜色素上皮細胞氧化應激損傷模型建立及ALA保護作用觀察。外源性過氧化氫(H2O2)梯度濃度作用于ARPE-19細胞,MTT法檢測細胞生存力,2'7'-二氯熒

2、光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)熒光探針檢驗細胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成,確定H2O2的適合作用濃度。Α-硫辛酸(ALA,37.5μM)作用于氧化應激下ARPE-19細胞,檢測細胞生存率和細胞內(nèi)ROS的改變。
　　 2.氧化應激下RPE細胞凋亡及Akt-bcl-2/Bax-Caspase-3途徑的變化和ALA干預的影響。適合濃度(12.5mM)的H2O2作用于ARPE-19(氧化應激組),Hoechst33258染色定性細胞凋亡,

3、AnnexinV FITC-PI雙染流式細胞術(shù)法定量檢測氧化應激下的細胞凋亡,Western Blot法檢測Akt磷酸化水平及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax蛋白表達,活性比色(DEVD法)檢測Caspase-3活性。氧化應激下ARPE-19細胞以α-硫辛酸處理(ALA處理組,37.5μM)0、2、4、6、8、10小時后,Hoechst染色定性細胞凋亡,Annexin V FITC-PI雙染流式細胞術(shù)法定量檢測ALA干預后細胞凋亡變化,W

4、estern Blot法檢測Akt磷酸化水平、凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax基因蛋白表達的變化,活性比色(DEVD法)檢測Caspase-3活性的改變。
　　 3.氧化應激下RPE細胞溶酶體穩(wěn)定性及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Atg-5、LC3的變化和ALA干預的影響。適合濃度(12.5mM)的H2O2作用于ARPE-19(氧化應激組),吖啶橙(AO)染色測定氧化應激下的細胞溶酶體膜穩(wěn)定性,Real-time PCR檢測自噬相關(guān)

5、基因Beclin-1和Atg-5的Mrna表達水平,Westem Blot法檢測Atg-5及LC3Ⅰ、Ⅱ的蛋白表達。氧化應激下ARPE-19細胞以α-硫辛酸處理(ALA處理組,37.5μM)0、2、4、6、8、10小時后,.AO染色測定ALA干預后細胞溶酶體膜穩(wěn)定性變化,Real-time PCR檢測自噬相關(guān)因子Beclin-1和Atg-5的Mrna表達水平變化,Western Blot法檢測Atg-5及LC3Ⅰ、Ⅱ的蛋白表達變化。

6、r>　　 結(jié)果：
　　 1.外源性H2O2作用下,ARPE-19的細胞生存力下降且呈劑量相關(guān)性,同時ARPE-19細胞內(nèi)的活性氧(ROS)濃度上升,提示H2O2處理可誘導ARPE-19細胞的氧化應激損傷;H2O2的適合作用濃度為12.5mM。ALA處理后,ARPE-19細胞氧化應激下的生存率增加,同時細胞內(nèi)的ROS濃度降低。
　　 2.氧化應激組ARPE-19細胞凋亡明顯增加,以早期凋亡為主(p＜0.05),晚期凋亡變

7、化不顯著;Akt的磷酸化水平增強,凋亡相關(guān)因子Bcl-2表達無明顯變化而Bax表達上升,Caspase-3活性上升。ALA處理組ARPE-19細胞2、4、6、8、10小時細胞凋亡百分率均下降,具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);Akt的磷酸化水平在4、6小時處顯著增強,凋亡相關(guān)因子Bax蛋白在4、6、8小時處的表達降低,Bcl-2的表達及Caspase-3活性在各時間點無顯變化。
　　 3.氧化應激組ARPE-19細胞酸性泡樣細胞器

8、(AVO)明顯增加,溶酶體的破裂增多,自噬相關(guān)基因Atg-5的Mrna及蛋白水平表達增加,Beclin-1的Mrna和LC3Ⅱ的蛋白表達上調(diào),LC3Ⅰ改變不明顯。ALA處理組ARPE-19細胞AO染色檢測結(jié)果顯示細胞溶酶體破裂減少,自噬相關(guān)因子Atg-5的Mrna及蛋白表達水平在4、6小時下調(diào),LC3Ⅱ的蛋白表達在作用4、6小時下調(diào),而Beclin-1的Mrna和LC3Ⅰ的蛋白檢測未顯示明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1

9、.外源性H2O2可誘導人視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19氧化應激,導致細胞損傷。Α-硫辛酸可降低細胞內(nèi)氧化應激水平,減少ARPE-19的細胞損傷及死亡,發(fā)揮保護作用。
　　 2.氧化應激下ARPE-19的細胞損傷可能與細胞凋亡增加有關(guān)。Α-硫辛酸對氧化應激下ARPE-19細胞的保護作用可能通過減少細胞凋亡實現(xiàn),這一作用可能與p-Akt的激活和Bax的表達下調(diào)相關(guān)。
　　 3.氧化應激下ARPE-19的細胞損傷可能與細胞自噬增