α-硫辛酸對氧化應(yīng)激下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 觀察α-硫辛酸(ALA)對外源性H2O2誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19細(xì)胞的氧化損傷是否具有保護(hù)作用,并通過細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬角度研究α-硫辛酸對氧化應(yīng)激下ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用途徑及其相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型建立及ALA保護(hù)作用觀察。外源性過氧化氫(H2O2)梯度濃度作用于ARPE-19細(xì)胞,MTT法檢測細(xì)胞生存力,2'7'-二氯熒

2、光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)熒光探針檢驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成,確定H2O2的適合作用濃度。Α-硫辛酸(ALA,37.5μM)作用于氧化應(yīng)激下ARPE-19細(xì)胞,檢測細(xì)胞生存率和細(xì)胞內(nèi)ROS的改變。
　　 2.氧化應(yīng)激下RPE細(xì)胞凋亡及Akt-bcl-2/Bax-Caspase-3途徑的變化和ALA干預(yù)的影響。適合濃度(12.5mM)的H2O2作用于ARPE-19(氧化應(yīng)激組),Hoechst33258染色定性細(xì)胞凋亡,

3、AnnexinV FITC-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)法定量檢測氧化應(yīng)激下的細(xì)胞凋亡,Western Blot法檢測Akt磷酸化水平及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax蛋白表達(dá),活性比色(DEVD法)檢測Caspase-3活性。氧化應(yīng)激下ARPE-19細(xì)胞以α-硫辛酸處理(ALA處理組,37.5μM)0、2、4、6、8、10小時(shí)后,Hoechst染色定性細(xì)胞凋亡,Annexin V FITC-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)法定量檢測ALA干預(yù)后細(xì)胞凋亡變化,W

4、estern Blot法檢測Akt磷酸化水平、凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax基因蛋白表達(dá)的變化,活性比色(DEVD法)檢測Caspase-3活性的改變。
　　 3.氧化應(yīng)激下RPE細(xì)胞溶酶體穩(wěn)定性及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Atg-5、LC3的變化和ALA干預(yù)的影響。適合濃度(12.5mM)的H2O2作用于ARPE-19(氧化應(yīng)激組),吖啶橙(AO)染色測定氧化應(yīng)激下的細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性,Real-time PCR檢測自噬相關(guān)

5、基因Beclin-1和Atg-5的Mrna表達(dá)水平,Westem Blot法檢測Atg-5及LC3Ⅰ、Ⅱ的蛋白表達(dá)。氧化應(yīng)激下ARPE-19細(xì)胞以α-硫辛酸處理(ALA處理組,37.5μM)0、2、4、6、8、10小時(shí)后,.AO染色測定ALA干預(yù)后細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性變化,Real-time PCR檢測自噬相關(guān)因子Beclin-1和Atg-5的Mrna表達(dá)水平變化,Western Blot法檢測Atg-5及LC3Ⅰ、Ⅱ的蛋白表達(dá)變化。

6、r>　　 結(jié)果：
　　 1.外源性H2O2作用下,ARPE-19的細(xì)胞生存力下降且呈劑量相關(guān)性,同時(shí)ARPE-19細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)濃度上升,提示H2O2處理可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷;H2O2的適合作用濃度為12.5mM。ALA處理后,ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激下的生存率增加,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度降低。
　　 2.氧化應(yīng)激組ARPE-19細(xì)胞凋亡明顯增加,以早期凋亡為主(p＜0.05),晚期凋亡變

7、化不顯著;Akt的磷酸化水平增強(qiáng),凋亡相關(guān)因子Bcl-2表達(dá)無明顯變化而Bax表達(dá)上升,Caspase-3活性上升。ALA處理組ARPE-19細(xì)胞2、4、6、8、10小時(shí)細(xì)胞凋亡百分率均下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);Akt的磷酸化水平在4、6小時(shí)處顯著增強(qiáng),凋亡相關(guān)因子Bax蛋白在4、6、8小時(shí)處的表達(dá)降低,Bcl-2的表達(dá)及Caspase-3活性在各時(shí)間點(diǎn)無顯變化。
　　 3.氧化應(yīng)激組ARPE-19細(xì)胞酸性泡樣細(xì)胞器

8、(AVO)明顯增加,溶酶體的破裂增多,自噬相關(guān)基因Atg-5的Mrna及蛋白水平表達(dá)增加,Beclin-1的Mrna和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)上調(diào),LC3Ⅰ改變不明顯。ALA處理組ARPE-19細(xì)胞AO染色檢測結(jié)果顯示細(xì)胞溶酶體破裂減少,自噬相關(guān)因子Atg-5的Mrna及蛋白表達(dá)水平在4、6小時(shí)下調(diào),LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)在作用4、6小時(shí)下調(diào),而Beclin-1的Mrna和LC3Ⅰ的蛋白檢測未顯示明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1

9、.外源性H2O2可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮ARPE-19氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞損傷。Α-硫辛酸可降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平,減少ARPE-19的細(xì)胞損傷及死亡,發(fā)揮保護(hù)作用。
　　 2.氧化應(yīng)激下ARPE-19的細(xì)胞損傷可能與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。Α-硫辛酸對氧化應(yīng)激下ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用可能通過減少細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn),這一作用可能與p-Akt的激活和Bax的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。
　　 3.氧化應(yīng)激下ARPE-19的細(xì)胞損傷可能與細(xì)胞自噬增