缺氧預(yù)處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)大鼠心肌梗死后心功能的恢復(fù).pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景： 心肌梗死是充血性心力衰竭的重要原因之一。近年來(lái)，盡管藥物治療和介入治療得到了快速發(fā)展，使缺血性心肌病患者的預(yù)后有了明顯的改善，但藥物治療和介入治療不能修復(fù)壞死的心肌。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植療法可促進(jìn)梗死局部血管新生和心肌再生而改善心肌梗死后心功能，已初步進(jìn)入了臨床應(yīng)用，也成為了目前心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?；A(chǔ)研究已經(jīng)表明在心肌梗死后移植MSC，在局部心肌微環(huán)境的作用下，MSC可分化為心肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新

2、生血管的形成，改善心功能。臨床試驗(yàn)也證實(shí)MSC移植治療心肌梗死可改善急性心肌梗死后左室收縮功能，且未發(fā)現(xiàn)負(fù)性臨床事件如支架內(nèi)再狹窄、致心律失常作用。雖然基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)都證實(shí)MSC移植治療心肌梗死是安全有效的，但是大量的證據(jù)表明MSC移植對(duì)心功能的改善是輕中度的，大部分研究結(jié)果顯示MSC移植對(duì)心功能的改善只有5-6％左右[4]，而有些臨床試驗(yàn)甚至沒(méi)有觀察到心功能的改善。其中很關(guān)鍵的因素是MSC移植后大部分細(xì)胞不能在移植局部存活。研究報(bào)

3、道90％的MSC在移植后1天內(nèi)死亡，因此，提高M(jìn)SC的存活率是提高干細(xì)胞移植療效的關(guān)鍵。刺激新生血管的形成對(duì)缺血性心肌病有很好的治療效果。促進(jìn)心肌梗死區(qū)域的新生血管形成是MSC移植能改善心功能恢復(fù)的機(jī)制之一。因此，有理由假設(shè)，增強(qiáng)MSC的促新生血管形成能力將進(jìn)一步提高心肌梗死后MSC移植的治療效果。 缺氧預(yù)處理(HP)是通過(guò)非致命的低氧刺激激活內(nèi)源性的保護(hù)性反應(yīng)，包括保護(hù)性蛋白的激活，從而提高細(xì)胞或機(jī)體的抗凋亡能力。缺氧預(yù)處理在

4、其他許多細(xì)胞系中已被作為一種保護(hù)細(xì)胞凋亡和刺激血管再生的有力工具，但缺氧預(yù)處理是否能增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和促新生血管形成目前未有報(bào)道。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?研究缺氧預(yù)處理是否能增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)存活能力，是否能增強(qiáng)MSC的促新生血管形成能力，移植缺氧預(yù)處理后的MSC能否進(jìn)一步提高心肌梗死后的心功能恢復(fù)，并探討其作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 將取自GFP小鼠的MSC在體外培養(yǎng)后分為兩組，正常氧培養(yǎng)組(N

5、-MSC)和缺氧預(yù)處理組(HP-MSC)，HP-MSC為0.5％O2濃度下培養(yǎng)24小時(shí)。為明確HP對(duì)MSC的細(xì)胞生長(zhǎng)因子和抗凋亡基因蛋白表達(dá)的影響，通過(guò)western檢測(cè)了兩組細(xì)胞的促紅細(xì)胞生產(chǎn)素(EPO)及其受體(EPO-R)，血管生產(chǎn)素1(Ang-1)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體(Flk-1)的表達(dá)情況，以及NF-κB、bcl-2、bcl-xl、caspase-3的表達(dá)情況；為了評(píng)價(jià)HP對(duì)MSC存活的影響，在體外，通過(guò)

6、去血清培養(yǎng)24小時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定各組細(xì)胞的死亡率，caspase-3染色測(cè)定細(xì)胞的凋亡；為了進(jìn)一步證實(shí)移植后HP-MSC是否有更強(qiáng)的存活能力和促新生血管形成能力，是否能更好地改善心肌梗死后的心功能恢復(fù)，進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分sham組、MI對(duì)照組、MI+N-MSC移植組，MI+HP-MSC移植組。通過(guò)結(jié)扎左前降支動(dòng)脈建立大鼠心肌梗死模型，30分鐘后，根據(jù)分組情況移植細(xì)胞，MI對(duì)照組移植等量的DMEM。移植后24小時(shí)

7、和72小時(shí)，分別處死動(dòng)物，心臟冰凍切片標(biāo)本行TUNEL染色和caspase-3染色檢測(cè)移植細(xì)胞的死亡率和凋亡率。移植后6周，行頸內(nèi)動(dòng)脈插管通過(guò)Powerlab系統(tǒng)測(cè)定心臟血流動(dòng)力學(xué)，而后處死動(dòng)物，心臟冰凍切片標(biāo)本行血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31、平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)染色評(píng)價(jià)新生血管形成情況，通過(guò)肌球蛋白重鏈(MHC)染色評(píng)價(jià)移植細(xì)胞的分化情況，行HE染色和Masson三色染色測(cè)量心肌梗死的面積。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 正常培養(yǎng)下的M

8、SC表達(dá)EPO，Ang-1，VEGF，F(xiàn)lk-1，EPO-R多種生長(zhǎng)因子，缺氧預(yù)處理能增加MSC這些生長(zhǎng)因子的表達(dá)；缺氧預(yù)處理能激活NF-κB，并上調(diào)bcl-2，bcl-xl的表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因caspase-3的表達(dá)；缺氧預(yù)處理本身并不增加MSC的死亡，去血清培養(yǎng)后，N-MSC和HP-MSC的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞和臺(tái)盼蘭陽(yáng)性細(xì)胞均明顯增加，然而HP-MSC組的caspase-3陽(yáng)性率和臺(tái)盼蘭陽(yáng)性率明顯低于N-MSC組，說(shuō)明HP

9、能保護(hù)MSC在去血清條件下的死亡；體內(nèi)移植后，HP-MSC移植組在移植后24小時(shí)和72小時(shí)的移植細(xì)胞TUNEL，陽(yáng)性率和caspase-3陽(yáng)性率均明顯比N-MSC組低。移植后6周，MHC染色顯示只有少量的MSC發(fā)展為心肌樣細(xì)胞，但不能確定是分化為心肌細(xì)胞還是與宿主細(xì)胞融合。CD31和SMA染色顯示細(xì)胞移植組總的血管密度/面積和動(dòng)脈血管密度/面積較MI組顯著增加，而HP-MSC移植組較N-MSC移植組增加更加明顯，說(shuō)明HP-MSC有更強(qiáng)的

10、新生血管形成能力。HE染色和Masson三色染色顯示細(xì)胞移植后能縮小心梗面積，且HP-MSC移植組的心梗面積最小。6周后，經(jīng)血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定各組心功能的恢復(fù)情況，顯示MI后，左室收縮壓(INSP)、左室壓力上升的最大速率(+dp/dt)和左室壓力下降的最大速率(-dp/dt)較sham組明顯下降，左室舒張末壓力(LVEDP)明顯升高；在兩組細(xì)胞移植組，LVSP、+dp/dt和-dp/dt均得到明顯改善，但HP-MSC移植組心功能的改善較N