雷奈酸鍶對內(nèi)側半月板切除術誘導豚鼠繼發(fā)性骨關節(jié)炎的作用及機制研究.pdf

1、第一部分：內(nèi)側半月板切除術導致豚鼠繼發(fā)性骨關節(jié)炎模型的觀察
　　目的:探討豚鼠內(nèi)側半月板切除（medial menisectomy,MNX）后關節(jié)炎的發(fā)生特點、軟骨組織病理變化，來評價骨性關節(jié)模型的建立是否成功，為后期實驗提供正確的使用模型。
　　方法:
　　1、3月齡雄性DH豚鼠24只，隨機將動物分為2組（n=12）：Sham組和MNX組，分別行假手術和內(nèi)側半月板切除術。
　　2、所有動物術后飼養(yǎng)12周處死，利

2、用OARSI關節(jié)評分系統(tǒng)對關節(jié)退變情況進行評估，利用免疫組化技術對軟骨組織中OA相關因子表達水平進行分析，利用Micro-CT技術對脛骨平臺側的軟骨下骨進行掃描記錄，分析內(nèi)側半月板切除術對軟骨下骨的作用。
　　結果:
　　1、兩組動物體重隨時間逐漸增長，各時間點兩組間體重無顯著差異；
　　2、 OARSI大體評分結果顯示， MNX組評分高于Sham組（MNX組vs.Sham組，2.92±0.20 vs.0.83±0.5

3、2，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義；
　　3、 MNX組動物術后關節(jié)退變嚴重，OARSI組織學評分顯示MNX組總分及CS、PG、CL和OST子項評分均顯著高于Sham組（P<0.05）；
　　4、與Sham組相比，MNX動物的脛骨平臺軟骨負重區(qū)AGG表達水平顯著下降（P＜0.001），ADAMTS4（P＜0.05）、Caspase3（P＜0.001）和MMP13（P＜0.05）的表達水平則顯著增高。此外，AGG/ADAM

4、TS4比值（P＜0.05）和Col-II/MMP13比值（P＜0.05）顯著下降，而Col-II/AGG比值顯著升高（P＜0.05）。
　　5、 Micro-CT檢測結果：MNX組可見關節(jié)邊緣內(nèi)側緣性骨組織增生明顯，脛骨上端下骨小梁顯著減少。與Sham組相比，MNX組動物脛骨平臺軟骨下骨BMD顯著降低（P＜0.05），BV/TV、Tb.Th顯著降低（P＜0.05）， Tb.Sp和SMI顯著增加（P＜0.05）。
　　第二部分

5、：雷奈酸鍶對內(nèi)側半月板切除術誘導豚鼠關節(jié)炎的作用
　　目的:Dunkin-Hartley（DH）豚鼠內(nèi)側半月板切除（MNX）導致繼發(fā)性骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）模型后，早期應用雷奈酸鍶（strontium ranelate，SR），探討SR對MNX豚鼠關節(jié)炎的作用。
　　方法:
　　1、3月齡DH雄性豚鼠36只，隨機分為三組，每組各12只：MNX+NS組、MNX+CLX組和MNX+SR組，每組再隨機

6、分成2個亞組（n=6）,一亞組用于大體觀察，另一亞組用于組織學觀察，適應性飼養(yǎng)1周后對各組進行右膝關節(jié)內(nèi)側半月板切除術。
　　2、術后一周開始給藥， MNX+SR組給予SR625mg/kg/d灌胃， MNX+CLX組給予CLX20mg/kg/day灌胃，MNX+NS組給予等量生理鹽水灌胃。
　　3、給藥12周后，處死動物并解剖右膝關節(jié)。通過肉眼觀察脛骨平臺和股骨髁的顏色、平滑度、滑液性狀和關節(jié)表面磨損情況。應用OARSI進行

7、關節(jié)大體評分。制備標本切片，進行甲苯胺藍染色，依據(jù)OARSI組織學評分系統(tǒng)對內(nèi)側脛骨平臺損傷情況及骨贅情況進行評分。
　　結果：
　　1、 DH豚鼠隨著年齡的增長體重也逐漸增加。12周時 MNX+NS組、CLX組和MNX+SR組體重無顯著差異，說明SR給藥對豚鼠的生長和發(fā)育沒有顯著影響，不影響體重。
　　2、軟骨的OARSI大體評分：造模術后內(nèi)側脛骨平臺關節(jié)軟骨出現(xiàn)了明顯的磨損，脛骨內(nèi)側平臺軟骨表面變得粗糙，在軟骨的內(nèi)

8、側邊緣形成裂隙并有軟骨增生。給予CLX或SR的豚鼠術側OARSI大體評分均值較MNX+NS組略有降低，但均未見顯著差異。
　　3、軟骨組織學觀察結果：各組軟骨均發(fā)生嚴重退變，負重區(qū)軟骨嚴重受損，表現(xiàn)為軟骨缺失、甲苯胺藍染色減弱、形成細胞集群、潮線連續(xù)中斷、關節(jié)內(nèi)側邊緣有骨贅形成。OARSI組織學評分結果顯示：MNX+CLX組的總評分均顯著低于MNX+NS組（MNX+CLX組vs. MNX+NS組，10.78±1.91vs.17.3

9、6±1.92，P＜0.05），而MNX+SR組總評分與MNX+NS組相比未見顯著差異。軟骨厚度測量結果顯示，MNX+CLX組動物軟骨厚度顯著高于MNX+NS組（MNX+CLX組 vs. MNX+NS組，360.19±38.93μmvs.264.73±58.01μm，P＜0.05），而MNX+SR組軟骨厚度與MNX+NS組相比未見顯著差異。此外，MNX+SR組骨贅高度顯著高于MNX+NS組（MNX+SR組vs. MNX+NS組，198.1

10、8±48.31μmvs.106.86±57.11，P＜0.05），MNX+CLX組骨贅高度略小于MNX+NS組，但未見統(tǒng)計學差異。
　　4、骨贅塌陷的觀察：大體觀察SR組中有5個樣品有塌陷骨贅的表現(xiàn)，而MNX組僅有1個樣本表現(xiàn)相同的外觀，CLX組未見類似現(xiàn)象，這種變化在三組之間無顯著差異。組織學觀察SR組有2個樣本發(fā)生塌陷，結合大體和組織學觀察，SR組發(fā)生骨贅塌陷的標本為7個，而MNX組僅有1個，兩組差異具有統(tǒng)計學意義。
　

11、　第三部分：雷奈酸鍶對內(nèi)側半月板切除術誘導豚鼠關節(jié)炎的作用機制探討
　　目的:通過我們前部分的實驗觀察，SR并未能起到對關節(jié)炎的滿意效果，發(fā)現(xiàn)其（625mg/kg/day）未能阻止MNX豚鼠軟骨的退變，甚至SR的攝入導致關節(jié)炎骨贅的增生，甚至塌陷。因此，在本實驗通過對SR治療作用后的關節(jié)炎軟骨及軟骨下骨的進一步研究，來探討產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機制。
　　方法:
　　1、3月齡DH雄性豚鼠36只，隨機分為三組，每組各12只：M

12、NX+NS組、MNX+CLX組和MNX+SR組，每組再隨機分成2個亞組（n=6）,一亞組用于Micro-CT檢測，另一亞組用于免疫組化檢測，適應性飼養(yǎng)1周后對各組進行右膝關節(jié)內(nèi)側半月板切除術。
　　2、術后一周開始MNX+SR組給予SR625mg/kg/day灌胃，MNX+CLX組給予CLX20mg/kg/day灌胃，MNX+NS組給予等量生理鹽水灌胃。
　　3、給藥12周后處死動物，解剖右膝關節(jié), Micro-CT掃描檢測

13、脛骨平臺軟骨下骨，測定骨礦物質密度（BMD）、骨微結構指數(shù)（BV/TV），骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數(shù)量（Tb.N），骨小梁分離度（Th.Sp）和結構結構模型指數(shù) SMI），各向異性程度（DA）來分析給予CLX和SR對內(nèi)側半月板切除后軟骨下骨的影響。制備標本切片后，進行免疫組化檢測，一抗分別為為：AGG（1：200），ADAMTS-4（1：200），Caspase-3（1：200），Col-II（1:50），和MMP-13（1：2

14、00）。
　　結果：
　　1、免疫組化結果：三組間AGG、Col-II、Caspase3和MMP13在內(nèi)側脛骨平臺負重區(qū)的表達結果未見顯著差異，而MNX+CLX組的ADAMTS4在術側內(nèi)側脛骨平臺負重區(qū)的表達水平顯著低于MNX+NS組（MNX+CLX組 vs. MNX+NS組，5243.96±2507.38 vs.11153.19±1958.72，P＜0.05）。此外，內(nèi)側脛骨平臺負重區(qū)AGG/ADAMTS4表達水平的比值在

15、MNX+CLX組顯著高于MNX+NS組（MNX+CLX組 vs. MNX+NS組，1.28±0.63 vs.0.45±0.14，P＜0.05），而Col-II/MMP13和Col-II/AGG兩項指標在三組間未見差異。
　　2、內(nèi)側脛骨平臺軟骨下骨形態(tài)分析：CLX對軟骨下骨未造成顯著影響，而SR則顯著增強MNX豚鼠內(nèi)側脛骨平臺負重區(qū)軟骨下骨BMD，并且顯著改善了BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp和SMI等形態(tài)學參數(shù)。
　　結

16、論:
　　1、通過切除DH豚鼠右側膝關節(jié)內(nèi)側半月板誘發(fā)關節(jié)退變，主要表現(xiàn)為關節(jié)軟骨丟失、骨贅形成，軟骨基質中以及軟骨細胞表達蛋白多糖顯著減少，軟骨組織中基質成分與基質降解酶類比例失調(diào)，軟骨細胞表達凋亡相關因子caspase-3增多，與典型的骨關節(jié)炎表現(xiàn)類似。同時，DH豚鼠術側膝關節(jié)內(nèi)側脛骨平臺負重區(qū)軟骨下骨有明顯的骨量丟失，這一表現(xiàn)符合早期骨關節(jié)炎軟骨下骨的表現(xiàn)。因此，DH豚鼠MNX模型是一種早期骨關節(jié)炎模型。
　　2、在S

17、R的作用下DH豚鼠MNX模型術側膝關節(jié)內(nèi)側脛骨平臺負重區(qū)軟骨下骨的骨密度顯著提高，MNX導致的軟骨下骨形態(tài)改變被顯著抑制，但是未觀察到SR對MNX導致的關節(jié)退變有延緩作用，而目前臨床指南推薦用藥——塞來昔布表現(xiàn)出對關節(jié)退變有一定程度延緩作用。
　　3、雷奈酸鍶（625mg/kg/day）未能阻止MNX豚鼠軟骨的退變，這種結果產(chǎn)生的原因可能是由于SR未能抑制ADAMT4及MMP3的活性、進而未能阻止細胞外基質AGG降解，并且SR未能