循循環(huán)腫瘤DNA檢測HER2陽性復發(fā)轉移性乳腺癌靶向治療療效相關生物標記物的探索性研究.pdf

1、目的：抗HER2靶向藥物如曲妥珠單抗、拉帕替尼、帕妥珠單抗等聯(lián)合化學治療極大改善了HER2陽性乳腺癌患者的預后和生存。但是即便同為HER2陽性，不同乳腺癌患者對抗HER2治療的敏感性卻不盡相同，而且治療后的耐藥現(xiàn)象難以避免。因而，尋找一種能夠準確、便捷的藥物療效預測方法，是克服耐藥現(xiàn)象這一腫瘤治療難題需要首先解決的問題，這不僅能夠提高患者預后還能節(jié)約醫(yī)療資源。目前認為基因組突變是導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因，因而基因檢測被認為是最佳的療效

2、預測手段。為了克服腫瘤組織學檢測的時空異質(zhì)性，應用更為特異、相對無創(chuàng)、實時反映腫瘤基因組信息的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測技術，探究其在HER2陽性復發(fā)轉移性乳腺癌靶向治療療效相關生物標志物篩選中的應用價值。
　　方法：2014年3月6日至2014年12月10日，入組就診于該院乳腺腫瘤科，擬接受或接受抗HER2治療的晚期乳腺癌患者20例，采用二代測序技術檢測患者血漿循環(huán)游離DNA（cfDNA）在50個腫瘤原癌和抑癌基因熱點區(qū)域

3、上的突變情況，篩選出腫瘤相關基因的體細胞突變。共檢測了24例血液樣本，其中有8例血樣采集自患者一線抗HER2治療（即含曲妥珠單抗的聯(lián)合治療）療前且后期隨訪證實在該線治療中獲益（療效為CR、PR或SD超過6個月），故將這8例定義為抗HER2治療敏感組；16例樣本采集自患者至少一次抗HER2靶向治療進展后，故定義為抗HER2治療耐藥組。采集24例血液樣本中耐藥組有4例患者在治療中采集了2次血樣，其采集時間點分別為二線抗HER2藥物拉帕替尼治

4、療前和進展后。收集患者臨床資料，將臨床資料與腫瘤相關基因突變情況進行相關性分析。
　　結果：
　　1、共入組20例女性患者，中位確診年齡45歲（27-71歲）。24例血樣，15例激素受體陽性（62.5％），9例激素受體陰性（37.5%）。24例樣本采集后均接受抗HER2靶向治療，其中15例接受曲妥珠單抗聯(lián)合治療，7例接受拉帕替尼的聯(lián)合治療，另2例分別接受曲妥珠單抗聯(lián)合拉帕替尼的雙靶向治療和T-DM1的靶向治療。
　　2

5、、24例血細胞和血漿DNA樣本在50個基因的目標區(qū)域檢測覆蓋度為100%。血細胞DNA平均測序深度為1870×（1340~2640×），血漿DNA平均測序深度為10800×（4910~12860×）。24例樣本血漿DNA樣本文庫的中位濃度為14.95ng/μL（3.45~45.44 ng/μL），血細胞DNA樣本文庫的中位濃度為2.22 ng/μL（0.59~6.53 ng/μL）。
　　3、24個樣本中共檢測到46個腫瘤相關基因

6、上的486個非同義單核苷酸變異，未檢測到 GNA11，CSF1R，ALK和 NPM1四個基因上的單核苷酸變異（SNV），其中26個基因的SNV個數(shù)少于10，這26個基因分別為FGFR1，GNAQ，RB1，ABL1，BRAF，F(xiàn)GFR3，GNAS，HRAS，F(xiàn)LT3，AKT， RET，CDH1，CDKN2A，ERBB2，EZH2，IDH1，IDH2，MET，MLH1，NRAS， CTNNB1，JAK2，NOTCH1，PEPN11，JAK2

7、和MPL。
　　4、所有樣本至少能夠檢測到1個SNV（中位20個，1~51個），平均突變頻率（MAF）為3.9%（2~31.66%）。本研究24例樣本在50個腫瘤相關基因的熱點區(qū)域的突變率由100%至0%不等，其中 PIK3CA、KIT、TP53三個基因為本研究樣本中突變率最高的三個基因，24例HER2陽性晚期乳腺癌患者cfDNA在50個基因上的突變率具有顯著的基因組差異，反映出“長尾效應”的現(xiàn)象。
　　5、通過對比，發(fā)現(xiàn)7

8、個耐藥組特有的突變基因，這些基因在敏感組均未檢測到突變。該7個耐藥組特有突變基因分別為EGFR，GNAS，HRAS，MLH1，CDH1， NRAS和NOTCH1。這些突變包括：11個分別在7號外顯子、18號外顯子、19號和21號外顯子上的EGFR突變；7個分別在7號外顯子和8號外顯子上的GNAS突變；7個發(fā)生在2號外顯子和3號外顯子上的HRAS的突變；4個在8號外顯子和3號外顯子上的CDH1突變；4個11號外顯子上的MHL1突變；3個分

9、別為26號外顯子和27號外顯子上NOTHC1基因上的突變；以及4個在2號外顯子和3號外顯子上NRAS基因突變。
　　6、另外，在4例樣本的cfDNA中檢測到HER2基因突變，其中兩例樣本存在一個共同的HER2 p.S855I突變，查閱資料發(fā)現(xiàn)該突變目前還無文獻報道。并且這兩例共同存在HER2 p.S855I突變的患者，在抗HER2靶向治療中獲益明顯，無進展生存期（PFS）分別為48個月和35個月。
　　7、將本研究cfDNA

10、中檢測的46個腫瘤相關基因突變信息與患者臨床治療資料進行相關性分析顯示，ATM、KDR、PDGFRA三個基因突變與患者后一線抗HER2靶向治療的 PFS顯著相關。12例血樣存在 ATM基因的 SNV，突變率為50%，Kaplan-Meier生存分析顯示ATM突變與患者更長的PFS顯著相關，突變型患者中位PFS為10.5個月，野生型患者中位PFS為6.5個月（P=0.04，HR0.33，95%CI0.11-0.97）。另外，分別有8例和7

11、例血漿樣本具有KDR和PDGFRA基因突變，突變率分別為33.3%和29%，Kaplan-Meier生存分析顯示這兩個基因的突變與患者更短的PFS顯著相關。KDR突變型和野生型的中位 PFS時間分別為5.5和12.0個月（P=0.015，HR4.56，95%CI1.34~15.53）；PDGFRA突變型和野生型中位PFS時間為5.0和9.0個月（P=0.036，HR3.77，95%CI1.09~13.05）。
　　結論：
　

12、　1、擴增子測序技術檢測循環(huán)游離DNA，測序深度高、敏感性高，檢測可信度好，可用于乳腺癌的循環(huán)腫瘤DNA的檢測。由于僅檢測與腫瘤相關的50個基因的熱點突變區(qū)域，故檢測成本大幅降低，有利于臨床推廣。
　　2、HER2陽性復發(fā)轉移性乳腺癌的cfDNA在50個腫瘤相關基因熱點區(qū)域上的突變差異顯著，基因組的突變譜顯示出“長尾效應”現(xiàn)象。PIK3CA、TP53、KIT是這一類別最常發(fā)生突變的三個基因。另有26個基因突變發(fā)生率低，可能是HER

13、2陽性乳腺癌治療中潛在的驅(qū)動基因。
　　3、EGFR，GNAS，HRAS，MLH1，CDH1，NRAS和NOTCH1可能與HER2陽性乳腺癌靶向治療的耐藥相關。HER2基因p.S855I突變能夠預示患者HER2治療的長期獲益。循環(huán)腫瘤DNA檢測在監(jiān)測HER2靶向治療期間生物標記物的改變具有潛在的應用價值。
　　4、ATM、KDR、PDGFRA三個基因能夠預測HER2陽性乳腺癌靶向治療的敏感性，未來可能指導抗HER2治療臨床實