耐輻射球菌細(xì)胞內(nèi)錳離子水平調(diào)控相關(guān)蛋白研究.pdf

1、細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的金屬離子動(dòng)態(tài)平衡與細(xì)胞的生理生長(zhǎng)具有密切關(guān)系,許多過(guò)渡價(jià)態(tài)金屬離子,包括Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ca(Ⅱ)等,不但可以作為蛋白的輔因子參與細(xì)胞的多種氧化還原反應(yīng),還可以作為信號(hào)因子參與基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控,影響細(xì)胞的毒性以及極端抗性等。因此細(xì)胞內(nèi)金屬離子的調(diào)控對(duì)于細(xì)菌維持正常生理活動(dòng)至關(guān)重要,而關(guān)于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)金屬離子調(diào)控的研究也一直是微生物領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　 作為極端微生物家族的重要成員,耐輻射球菌對(duì)于電離輻射

2、、紫外線、化學(xué)誘變劑、干燥等具有極強(qiáng)抗性,而越來(lái)越多的研究表明,耐輻射球菌對(duì)于極端環(huán)境的適應(yīng)能力得益于其超強(qiáng)的抗氧化能力,其細(xì)胞內(nèi)積累的超高錳離子水平一直被認(rèn)為是其最重要的抗氧化機(jī)制之一,因此耐輻射球菌是極好的研究細(xì)菌細(xì)胞錳離子代謝調(diào)控的模式生物,通過(guò)研究其錳離子調(diào)控機(jī)制,不但可以進(jìn)一步了解耐輻射球菌的極端抗性機(jī)制,而且對(duì)于拓展細(xì)菌細(xì)胞金屬離子調(diào)控機(jī)制也具有重要意義。本文主要通過(guò)細(xì)胞吸收及外排兩個(gè)方面,研究了耐輻射球菌的細(xì)胞內(nèi)錳離子動(dòng)態(tài)

3、調(diào)控機(jī)制,研究結(jié)果如下:
　　 1.我們首次鑒定得到耐輻射球菌錳離子外排蛋白(Dr1236)。在構(gòu)建了Dr1236的基因缺失突變株后,我們發(fā)現(xiàn)突變株對(duì)于錳離子的抗性下降,而且細(xì)胞內(nèi)的錳離子水平顯著升高,說(shuō)明Dr1236在耐輻射球菌錳離子抗性及細(xì)胞內(nèi)錳離子動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制中,發(fā)揮了重要的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),突變株細(xì)胞內(nèi)錳離子濃度升高以后,其電離輻射、紫外、過(guò)氧化氫抗性都明顯增強(qiáng),表明細(xì)胞內(nèi)錳離子確實(shí)參與了細(xì)胞的極端抗性,而這種保護(hù)

4、作用很可能是通過(guò)降低自由基對(duì)蛋白的攻擊實(shí)現(xiàn)的。然而,雖然突變株細(xì)胞在積累了高水平錳離子之后,極端抗性有了不同程度的增加,但是細(xì)胞的生長(zhǎng)周期卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于野生株,表明錳離子的過(guò)高積累對(duì)細(xì)胞的整體機(jī)能造成了損傷,這也從側(cè)面反映出錳離子外排蛋白對(duì)于細(xì)胞的重要作用。
　　 2.dr0865編碼了耐輻射球菌唯一一個(gè)Fur同源蛋白,Fur蛋白在其它細(xì)菌中參與了錳離子吸收通道蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,因此我們利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)了dr0865,并研

5、究了其生化性質(zhì)。生物信息學(xué)研究表明,Dr0865很可能包含了結(jié)合三個(gè)金屬離子的結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)可能賦予了其獨(dú)特的生物學(xué)功能。DNA結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)表明,Dr0865可以與dr2283、dr2284、dr2524的啟動(dòng)子結(jié)合,而且結(jié)合活性與金屬離子的濃度成正比,另一方面卻不能與dr1709的啟動(dòng)子結(jié)合；β-半乳糖甘酶活性實(shí)驗(yàn)表明Dr0865與dr2283、dr2284、dr2523的啟動(dòng)子的結(jié)合可能促進(jìn)了其轉(zhuǎn)錄,考慮到Dr0865的DNA結(jié)合活

6、性依賴于金屬離子的濃度,及Dr0865突變株的過(guò)氧化氫抗性增強(qiáng),因此我們推測(cè)dr2283、dr2284、dr2523很可能編碼了一種鐵離子外排通道蛋白,而其具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。
　　 3.dr2539編碼耐輻射球菌的DtxR／MntR家族蛋白,這類蛋白家族對(duì)于細(xì)胞錳離子或鐵離子調(diào)控至關(guān)重要,通過(guò)在Dr2539 N-端融合表達(dá)助溶片段IF,我們成功得到Dr2539蛋白。DNA結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)表明,Dr2539只能與dr170

7、9的啟動(dòng)子結(jié)合,而且EMSA和β-半乳糖甘酶活性實(shí)驗(yàn)表明,蛋白的結(jié)合活性受到錳離子和鐵離子的調(diào)控,表明Dr2539與此前所報(bào)道的MntR蛋白結(jié)構(gòu)上可能存在很大差異,因此我們構(gòu)建了Dr2539突變體,并將突變體補(bǔ)償Dr2539突變株,包括C-D11M、C-H98Y、C-E101D、C-Tru,通過(guò)檢測(cè)補(bǔ)償株對(duì)于錳離子的抗性,發(fā)現(xiàn)C—D11M及C—Tru錳離子抗性相對(duì)于野生Dr2539補(bǔ)償株明顯下降,而C-E101D的抗性并沒(méi)有明顯變化；驚

8、奇的是,H98Y補(bǔ)償株對(duì)6-7Mm Mn(Ⅱ)極度敏感,這與此前所報(bào)道的DtxR激活模型一致,因此我們推測(cè),dr2539所編碼的MntR蛋白很可能利用一種類似于DtxR的激活模式,而且可能參與了細(xì)胞內(nèi)錳離子與鐵離子動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控。
　　 綜上所述,在研究了耐輻射球菌細(xì)胞內(nèi)錳離子外排和吸收系統(tǒng)后,我們的結(jié)果表明錳離子的確參與了耐輻射球菌的極端抗性機(jī)制,此外,金屬離子調(diào)控蛋白Dr0865和Dr2539的生化活性表明,耐輻射球菌的金屬