耐輻射球菌PprI蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)、發(fā)酵和純化技術(shù)的研究.pdf

1、目的:利用畢赤酵母高效表達(dá)耐輻射奇球菌PprI蛋白，對pxxx/YYY畢赤酵母重組工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)，并對PprI蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和發(fā)酵條件進(jìn)行研究，并建立相應(yīng)的表達(dá)、純化和發(fā)酵技術(shù)路線，獲得大量的PprI蛋白，為進(jìn)一步研究PprI蛋白的作用機(jī)理及生物效應(yīng)提供實驗資料。
　　 材料與方法:構(gòu)建畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒pxxx-His-pprI,將鑒定正確的重組質(zhì)粒pxxx6×His-pprI經(jīng)Sa1I酶切線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母YY

2、Y感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行篩選，挑取經(jīng)鑒定為陽性的pxxx-6×His pprI畢赤酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，加入甲醇至終濃度為1％進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳，Western blotting，質(zhì)譜鑒定目的蛋白。采用離子交換、SFF(Ni)鎳鰲合親和層析、凝膠層析過濾和咪唑洗脫進(jìn)行蛋白純化，SDS-PAGE電泳檢測。采用Bradford法進(jìn)行His-PprI蛋白質(zhì)濃度測定。外源蛋白表達(dá)條件，誘導(dǎo)時間、補(bǔ)加甲醇濃度、溶氧、發(fā)酵液pH值等方面逐個

3、進(jìn)行實驗優(yōu)化。用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)量，以蛋白含量高低及蛋白電泳條帶明暗為優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)的OD值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測蛋白樣品的濃度。
　　 結(jié)果:DNA測序結(jié)果表明合成的耐輻射奇球菌pprI基因編碼序列正確，畢赤酵母轉(zhuǎn)化菌株的培養(yǎng)上清液中經(jīng)SDS-PAGE、Western blotting和質(zhì)譜檢測證實PprI蛋白成功在畢赤酵母YYY中表達(dá)。實驗結(jié)果顯示在甲醇至終濃度0.8-1.2％，溫度28-30

4、℃，PH5.5-6.5時蛋白表達(dá)量最高為28-32g/L。用離子交換、SFF(Ni)鎳鰲合親和層析、凝膠層析過濾和咪唑洗脫進(jìn)行蛋白純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳、Western blot和質(zhì)譜檢測證實為PprI蛋白，相對分子質(zhì)量為43KD，蛋白量為0.35mg/mL，bradford法檢測濃度為95％。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建了耐輻射奇球菌PprI蛋白的畢赤酵母分泌表達(dá)工程菌株，并建立了其相應(yīng)的表達(dá)技術(shù)路線