生長(zhǎng)激素促分泌素受體基因敲除小鼠的建立及胃排空表型研究.pdf

1、生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GH S-R)編碼366個(gè)氨基酸，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，主要分布在丘腦及垂體，與其內(nèi)源性配體ghrelin結(jié)合后除了促生長(zhǎng)激素釋放作用以外還可以通過(guò)中樞和外周兩種方式調(diào)節(jié)胃動(dòng)力。GHS-R在胃動(dòng)力調(diào)控上的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究建立了GHS-R基因敲除小鼠模型，從胃排空方面研究了GHS-R基因敲除對(duì)小鼠胃排空的影響。為了探討其機(jī)理，使用基因芯片技術(shù)研究了敲除小鼠丘腦基因表達(dá)譜。 本研究采取置換型基因敲除載體

2、，使用正負(fù)篩選策略。用TK-neo置換原X-pPNT載體的PGK-neo構(gòu)建目標(biāo)載體骨架。以小鼠基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增兩條同源臂，將其按照一定方向裝入含有TK-neo的X-pPNT載體，并測(cè)序鑒定。載體經(jīng)線性化及純化后電穿孔轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞，用G418和Gancyclovir對(duì)電穿孔轉(zhuǎn)染后的ES細(xì)胞進(jìn)行正負(fù)篩選培養(yǎng)，得到雙藥抗性ES細(xì)胞克隆后抽提基因組DNA，分別用PCR方法鑒定兩條同源臂，并測(cè)序確定成功同源重組的ES細(xì)胞

3、克隆。經(jīng)ES細(xì)胞顯微注射及囊胚移植，獲得嵌合體小鼠，再由雜交育種得到純合子小鼠。以RT-PCR及免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了敲除小鼠GHS-R的mRNA及蛋白表達(dá)水平。使用13C-辛酸標(biāo)記試餐，進(jìn)行13 CO2呼氣試驗(yàn)，對(duì)基因敲除小鼠的胃排空進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。為了探討GHS-R敲除對(duì)小鼠胃排空影響的中樞作用機(jī)制，使用基因芯片研究了丘腦表達(dá)譜。 結(jié)果：成功構(gòu)建了基因敲除載體，獲得了基因敲除小鼠，并從mRNA及蛋白兩個(gè)水平證實(shí)其GHS-R無(wú)

4、表達(dá)。敲除小鼠胃排空較野生型小鼠要緩慢。液體試餐：GEC敲除小鼠為7.74±0.34>野生型小鼠的6.10±0.28(P=0.005)；固體試餐：t1/2(分鐘)敲除小鼠為112.43±5.69>野生型小鼠的83.96±3.95(P=0.004)；tlag(分鐘)敲除小鼠為53.76±2.52>野生型小鼠的32.77±3.18(P=0.001)。丘腦基因芯片結(jié)果顯示敲除小鼠基因表達(dá)的變化主要集中在生理功能的正向調(diào)控、蛋白代謝過(guò)程、細(xì)胞蛋