致病性弧菌PCR-DHPLC檢測(cè)及霍亂弧菌快速分型方法的建立.pdf

1、弧菌是對(duì)人類危害較大的一類細(xì)菌,它普遍存在于動(dòng)物性食品當(dāng)中。已經(jīng)被人類證明的對(duì)人類有致病性的弧菌有霍亂孤菌(V.eholerae)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnifcus)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus),溶藻弧菌(V.alginofjgticus)、擬態(tài)弧菌(V.mimicus)、梅氏弧菌(V.metschnikovii)等。其中創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌、只是偶爾對(duì)人類有致病性,而梅氏弧菌很少感染人類,僅有少數(shù)分

2、離株從人類的尿液、血液中被分離。這些弧菌都不允許在進(jìn)出口食品中檢出。目前,國(guó)內(nèi)關(guān)于致病性弧菌的檢測(cè)方法主要是生化鑒定法,此方法雖然經(jīng)典,但操作復(fù)雜,檢測(cè)耗費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間,不宜做大批量樣本的檢測(cè)；而且一些樣品中由于分離株生化反應(yīng)不典型,在實(shí)際工作中,其檢測(cè)鑒別存在一定困難,不適宜作為快速檢測(cè)弧菌的方法。因此不能適應(yīng)國(guó)際進(jìn)出口貿(mào)易的現(xiàn)實(shí)需要。因此,本研究目的在于能針對(duì)食品中的致病性弧菌建立一種既能快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法,同時(shí)還可以對(duì)霍亂弧菌

3、進(jìn)行快速分型的檢測(cè)方法,來減少工作量同時(shí)又能減少檢測(cè)成本,來滿足進(jìn)出口食品檢驗(yàn)的需要。
　　 以霍亂弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌和梅氏弧菌為研究對(duì)象,采用試劑盒法提取6種致病性弧菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA,用分光光度計(jì)檢測(cè)提取效果。根據(jù)6種弧菌的特異基因序列,設(shè)計(jì)并合成特異性引物,進(jìn)行6種弧菌的特異性、敏感度和實(shí)際樣品的PCR-DHPLC檢測(cè)。同時(shí)依據(jù)霍亂弧菌毒素相關(guān)基因:膠原酶基因(vcc基因),此基因是霍

4、亂弧菌共有基因；毒力基因(ctxA基因和tcpA基因),這兩個(gè)基因是O1群和O139群共有基因；O139群特有的毒力基因(LPSgt基因),分別設(shè)計(jì)合成了四對(duì)特異性引物,并對(duì)其PCR退火溫度和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化來確定最佳的反應(yīng)條件,進(jìn)行霍亂弧菌多重PCR-DHPLC快速分型檢測(cè)。
　　 用6種弧菌的特異性引物和霍亂弧菌相關(guān)毒素的特異性引物,經(jīng)各反應(yīng)體系和引物退火溫度的優(yōu)化后,建立了6種弧菌的PCR-DHPLC快速檢測(cè)方法和霍亂弧菌

5、Ol群、O139群,非O1群/非O139群的多重PCR-DHPLC快速分型方法。該6種PCR-DHPLC方法的檢測(cè)敏感度均低于60cfu/mL。
　　 本研究所建立的致病性弧菌的PCR-DHPLC檢測(cè)及霍亂弧菌快速分型的方法,與傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法和PCR-凝膠電泳法相比,具有快速、準(zhǔn)確、高效的優(yōu)點(diǎn),在致病性弧菌的檢測(cè)與霍亂弧菌快速血清分型上具有廣泛的應(yīng)用前景。通過本試驗(yàn)的研究,建立了快速檢測(cè)食品中致病性弧菌的新方法,并建立了霍亂