空腸彎曲菌聯(lián)合百日咳毒素致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)損傷的研究.pdf

1、目的:通過(guò)構(gòu)建空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，Cj）活菌口服灌胃，聯(lián)合腹腔注射百日咳毒素(pertussis toxin，PT)致Hartley豚鼠周圍神經(jīng)損傷的模型。探討空腸彎曲菌消化道感染后同時(shí)腹腔給予百日咳毒素對(duì)加重周圍神經(jīng)組織損傷的影響，進(jìn)而為周圍神經(jīng)病——吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）動(dòng)物模型的建立提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.空腸彎曲菌的培養(yǎng)

2、、鑒定及菌懸液的制備:選取吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)患者糞便中分離并培養(yǎng)出的空腸彎曲菌lulei株，經(jīng)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心鑒定為空腸彎曲菌菌株。用哥倫比亞血培養(yǎng)基于42℃，10％CO2、5％O2、85％N2條件培養(yǎng)空腸彎曲菌。并經(jīng)革蘭染色、馬尿酸水解實(shí)驗(yàn)及過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。純化菌種，制備3×108cfu/ml菌懸液。
　　2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將30只Hartley豚鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)

3、組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分為:A組:空腸彎曲菌lulei株+百日咳毒素組，B組:空腸彎曲菌lulei株+生理鹽水組;對(duì)照組分為:C組:布氏肉湯+百日咳毒素組，D組:布氏肉湯+生理鹽水組，E組:空白對(duì)照組。
　　3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻毒:口服灌喂Hartley豚鼠，灌喂前禁食12小時(shí)、禁水4小時(shí)。實(shí)驗(yàn)組A組、B組給予濃度為3×108cfu/ml的菌懸液，2ml/只，對(duì)照組C組、D組給予同等量的布氏肉湯進(jìn)行灌胃。灌胃周期為每周連續(xù)3天且連續(xù)4周進(jìn)行

4、。于第1周和第2周的第1次和第3次灌胃后，A組和C組腹腔注射0.5ml含1ug百日咳毒素的生理鹽水，B組、D組給予0.5ml生理鹽水。
　　4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床癥狀、病理觀察及病變統(tǒng)計(jì):自灌喂當(dāng)日起每日觀察豚鼠的臨床癥狀，定期稱量豚鼠體重，觀察豚鼠的皮毛情況。于末次攻毒后1周取材，分別取雙側(cè)坐骨神經(jīng)進(jìn)行鋨酸染色觀察及透射電鏡觀察，根據(jù)鋨酸染色病變率進(jìn)行x2檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察:根據(jù)臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)

5、分，實(shí)驗(yàn)組A組、B組和對(duì)照組C組、D組、E組臨床癥狀均為0級(jí)。實(shí)驗(yàn)組A組有1只豚鼠于第3周開(kāi)始出現(xiàn)腹部皮毛較臟現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組A組和B組整體體重增長(zhǎng)速度較慢。實(shí)驗(yàn)組A組、B組豚鼠與第3周開(kāi)始有掉毛的現(xiàn)象。
　　2.周圍神經(jīng)病理表現(xiàn):
　　2.1 鋨酸染色:實(shí)驗(yàn)組A組豚鼠坐骨神經(jīng)部分纖維粗細(xì)不等，髓鞘節(jié)段性皺縮、斷裂，呈“長(zhǎng)城樣”改變，部分神經(jīng)單絲斷裂;實(shí)驗(yàn)組B組豚鼠坐骨神經(jīng)部分纖維呈“鋸齒樣”改變，節(jié)段性皺縮，神經(jīng)纖維粗細(xì)不均勻

6、;對(duì)照組豚鼠坐骨神經(jīng)纖維鋨酸染色未見(jiàn)異常。
　　2.2 透射電鏡觀察:實(shí)驗(yàn)組A組豚鼠坐骨神經(jīng)髓鞘粗細(xì)不等，板層結(jié)構(gòu)消失，并出現(xiàn)斷裂缺如，部分軸索被壓迫消失;實(shí)驗(yàn)組B組豚鼠坐骨經(jīng)髓鞘部分板層結(jié)構(gòu)消失，融合紊亂，微絲微管排列緊密，線粒體嵴模糊。對(duì)照組神經(jīng)髓鞘粗細(xì)均勻，板層結(jié)構(gòu)完整，微絲微管排列正常。
　　3.神經(jīng)纖維病變率及統(tǒng)計(jì)分析:
　　3.1 神經(jīng)纖維病變率:實(shí)驗(yàn)組中周圍神經(jīng)存在損傷的Hartley豚鼠占100％，實(shí)驗(yàn)

7、組和對(duì)照組Hartley豚鼠周圍神經(jīng)的平均病變率不同，實(shí)驗(yàn)組A組病變率為47.3％，實(shí)驗(yàn)組B組病變率為18.8％，對(duì)照組C組病變率為3.8％，對(duì)照組D組病變率為2.5％，空白對(duì)照組E組病變率為2.8％。
　　3.2 病變率統(tǒng)計(jì)分析:對(duì)資料進(jìn)行x2檢驗(yàn)，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，神經(jīng)纖維平均病變率比較采用x2檢驗(yàn)，進(jìn)行雙側(cè)性顯著檢測(cè)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。得出P＜0.05，認(rèn)為各組的發(fā)病率不全相等。進(jìn)一步進(jìn)行組間

8、比較，采用x2分割法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，需進(jìn)行A組、B組、C組、D組分別與E組比較，以及A組與B組比較，校正后檢驗(yàn)水準(zhǔn)α'=0.01。A組與E組比較，得出P＜0.01，認(rèn)為A組和E組病變率不同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且A組病變率高于E組病變率;B組和E組比較，得出P＜0.01，認(rèn)為B組和E組病變率不同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且B組病變率高于E組病變率;C組和E組比較，得出P＞0.01，認(rèn)為C組和E組病變率相同，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;D組和E組比較，得出P

9、＞0.01，認(rèn)為D組和E組病變率相同，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組和B組比較，得出P＜0.01，認(rèn)為A組和B組病變率不同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且A組病變率高于B組病變率。
　　結(jié)論:
　　1.消化道感染空腸彎曲菌能夠?qū)е?周齡Hartley豚鼠周圍神經(jīng)損傷，周圍神經(jīng)存在損傷的豚鼠占100％，且周圍神經(jīng)纖維平均病損率為18.8％。
　　2.消化道感染空腸彎曲菌后進(jìn)行腹腔注射百日咳毒素導(dǎo)致3周齡Hartley豚鼠周圍神經(jīng)損傷，周圍神經(jīng)存在