百日咳桿菌氣管定植因子(TcfA)的功能分析.pdf

1、百日咳是由百日咳鮑特氏菌(以下簡稱百日咳桿菌)引起的一種呼吸道傳染病,在嬰幼兒當(dāng)中較為常見。百日咳桿菌致病機理包括粘附、侵襲、產(chǎn)毒等一系列的過程。絲狀血凝素(Filamentous hemagglutmin)、粘附素(Pertactin)、百日咳氣管定植因子(Tracheal colonization factor; TcfA)等諸多膜表面蛋白參與到細菌的粘附過程。百日咳氣管定植因子是百日咳桿菌膜表面蛋白,相關(guān)文獻報道,推測該蛋白可能是

2、百日咳桿菌的粘附分子,但對其粘附功能尚未進行系統(tǒng)的驗證。因此本研究采用DNA重組技術(shù),在大腸桿菌(BL21;DE3)內(nèi)表達TcfA蛋白,并純化重組TcfA蛋白。然后通過重組表達菌的體外細胞粘附實驗、重組蛋白免疫熒光實驗、競爭抑制實驗證明TcfA蛋白的黏附作用。并在此基礎(chǔ)上,就TcfA蛋白第317-319位RGD三聯(lián)肽的功能進行驗證。同時通過構(gòu)建FHA-PRN-基因缺失株,探究TcfA蛋白在粘附過程中的重要性,并嘗試找出TcfA蛋白與經(jīng)典

3、模型細胞HeLa相互作用的受體。
　　通過基因重組技術(shù)成功的表達了TcfA蛋白,并純化出純度達85％的重組蛋白,免疫印跡實驗結(jié)果顯示,重組蛋白能與疫苗生產(chǎn)菌株(CS菌)全菌體血清發(fā)生抗原抗體反應(yīng),說明重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性和抗原特異性;玻片凝集實驗和V管凝集實驗證明TcfA蛋白表達于大腸桿菌膜表面;熒光粘附試驗證實表達有TcfA的大腸桿菌與含有空載體的大腸桿菌對經(jīng)典模式細胞的粘附有明顯的差異,CFU實驗定量證實兩者之間具有統(tǒng)

4、計學(xué)差異。粘附ELISA實驗從另一技術(shù)方法反映了兩者之間具有統(tǒng)計學(xué)差異。重組蛋白的免疫熒光實驗間接反映了 TcfA蛋白與細胞受體的相互作用,重組蛋白的競爭抑制實驗表明TcfA蛋白能競爭抑制重組TcfA大腸桿菌的粘附,并表現(xiàn)出蛋白濃度的依賴性。TcfA小鼠多抗封閉實驗結(jié)果顯示,封閉了重組大腸桿菌膜表面的TcfA蛋白,細菌的粘附率出現(xiàn)明顯的下降,說明了TcfA蛋白的粘附的特異性(依賴性)。含RGD的短肽與含RGE的短肽的競爭抑制試驗表明,T

5、cfA蛋白可能通過其氨基酸位點上的RGD模序發(fā)揮作用。慶大霉素胞外殺傷實驗是檢測病原菌是否具有入侵宿主細胞能力的有效方法之一,該方法主要是檢測粘附分子是否介導(dǎo)了病原菌的入侵。實驗結(jié)果顯示,TcfA蛋白并不介導(dǎo)重組大腸桿菌入侵HeLa細胞。FHA、PRN基因缺失株與抗TcfA小鼠多克隆抗體作用后,粘附力相比于FHA、PRN基因缺失株和CS野生株有較明顯的下降,說明TcfA蛋白作為百日咳桿菌膜表面的一個粘附因子,在細菌的粘附過程中發(fā)揮著重要