環(huán)境污染物多氯聯(lián)苯、全氟辛烷磺酸激活胰島β細(xì)胞NLRP3炎癥小體信號及機(jī)制研究.pdf

1、目的：糖尿病為第二大慢性非傳染疾病，糖尿病及其急慢性并發(fā)癥嚴(yán)重地影響著糖尿病患者的生活質(zhì)量及壽命，但目前糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究表明糖尿病為遺傳因素和環(huán)境因素之間復(fù)雜的相互作用所導(dǎo)致。越來越多的證據(jù)表明，環(huán)境污染與糖尿病發(fā)病關(guān)系密切。持久性有機(jī)污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs）中的多氯聯(lián)苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）、全氟辛烷磺酸(Perfluoroo

2、ctane sulphonate，PFOS)具有生物蓄積性、持久性、高毒性及遠(yuǎn)距離遷移性等特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)全球范圍內(nèi)能在人體、動物、環(huán)境中檢測到它們的存在，且與多種疾病比如糖尿病、甲狀腺疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，但持久性有機(jī)污染物中的PCBs、PFOS能否導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生及具體機(jī)制目前仍不明了。糖尿病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是長期低度炎癥反應(yīng)的發(fā)生，且固有免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)為重要環(huán)節(jié)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（即

3、NLRP3）為固有免疫反應(yīng)中的一員，被細(xì)胞內(nèi)外的危險信號分子通過多種途徑激活，比如活性氧（ROS）的產(chǎn)生等，進(jìn)而活化半胱氨酸蛋白水解酶（Caspase-1）信號途徑，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)能在糖尿病患者體內(nèi)檢測到高濃度的環(huán)境污染物，比如PCBs、PFOS、二噁英、雙酚A等，且也能檢測到高濃度的炎癥因子，但PCB118、PFOS能否通過 ROS機(jī)制激活胰島β細(xì)胞NLRP3炎癥小體導(dǎo)致胰島β細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)而參與糖尿病的發(fā)生目前尚不

4、清楚。本研究旨在探討持久性有機(jī)污染物中的多氯聯(lián)苯118（PCB118）、全氟辛烷磺酸(PFOS)對小鼠胰島β-TC-6細(xì)胞中ROS、NLRP3炎癥小體信號分子、炎癥因子表達(dá)的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)對象及處理因素：實(shí)驗(yàn)對象為小鼠胰島β-TC-6細(xì)胞，體外培養(yǎng)該細(xì)胞，干預(yù)因子為不同濃度的PCB118、PFOS,抑制劑為活性氧抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC）。
　　2、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：使用不同濃度的PCB1

5、18（5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L、160nmol/L、320nmol/L）、PFOS(1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L、10000nmol/L)分別干預(yù)小鼠胰島β-TC-6細(xì)胞48h及72h，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)分別檢測PCB118、PFOS對該細(xì)胞的毒性作用。
　　3、實(shí)驗(yàn)分組：PCB1

6、18干預(yù)時，將小鼠胰島β-TC-6細(xì)胞分為二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶劑對照組、不同濃度PCB118組（5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L）及PCB118+ NAC組（于表達(dá)變化最強(qiáng)的濃度組中預(yù)先加入10umol/L的活性氧抑制劑NAC抑制活性氧的產(chǎn)生，了解ROS在PCB118激活小鼠胰島β-TC-6細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的作用）；PFOS干預(yù)時，將小鼠胰島β-TC-6細(xì)胞分為甲醇溶劑

7、對照組、不同濃度PFOS組（1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L）及PFOS+NAC組（于表達(dá)變化最強(qiáng)的濃度組中預(yù)先加入10umol/L的活性氧抑制劑NAC抑制活性氧的產(chǎn)生，了解ROS在PFOS激活小鼠胰島β-TC-6細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的作用）。
　　4、檢測方法：⑴各組小鼠胰島β-TC-6細(xì)胞培養(yǎng)至適當(dāng)時機(jī)隨機(jī)加入不同的作用物培養(yǎng)48h及72h，使用CCK-8試劑盒檢測不同濃度PCB118、PFOS對小鼠胰

8、島β-TC-6細(xì)胞的毒性作用。⑵各組小鼠胰島β-TC-6細(xì)胞培養(yǎng)至適當(dāng)時機(jī)隨機(jī)加入不同的干預(yù)物培養(yǎng)48h：①裝載2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針（2',7'-Dichlorofluorescin Diacetate，DCFH-DA），用全光譜分光光度計檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)水平。②采用蛋白免疫印跡（Western-blot）法檢測各組NLRP3、Pro-Caspase-1、Caspase-1、Pro-IL-1β、IL-1β蛋白的表

9、達(dá)。③取細(xì)胞培養(yǎng)液離心后采用ELISA法檢測IL-6、IL-18、C-C趨化因子配體2(CCL-2)炎癥因子的表達(dá)水平。
　　5、統(tǒng)計學(xué)分析：采用統(tǒng)計分析軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，各組內(nèi)比較采用的是方差齊性檢驗(yàn)，各組間比較采用的是單因素方差分析，各組間的多重比較采用的是LSD-t方法，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05， P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)

10、胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，PCB118干預(yù)細(xì)胞48h時，各濃度對細(xì)胞沒有明顯的毒性，各濃度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；干預(yù)72h，濃度大于等于80nmol/L時，對細(xì)胞有明顯毒性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；PFOS干預(yù)細(xì)胞48h、72h，濃度為10000nmol/L時，對細(xì)胞有明顯毒性，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.不同濃度的PCB118、PFOS對小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)的ROS、NLRP3炎癥小體信號分子表達(dá)的

11、影響：與溶劑對照組相比，PCB118、PFOS均可上調(diào)ROS及NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白的表達(dá)(P<0.05)，下調(diào)Pro-Caspase-1、Pro-IL-1β蛋白的表達(dá)(P<0.05)，且呈濃度依賴性。與高濃度的PCB118、PFOS組相比，NAC預(yù)處理可阻止PCB118、PFOS誘導(dǎo)的ROS及NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)的上調(diào)(P<0.05)和Pro-Caspase-1、Pro-IL-1β