脂代謝紊亂血管病變中淋巴細(xì)胞免疫組庫(kù)特征的研究.pdf

1、背景:
　　我國(guó)血脂異?；疾÷食尸F(xiàn)急劇增加的趨勢(shì)，血脂代謝紊亂與糖尿病、高血壓、非酒精性脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。脂代謝紊亂引起的高血脂、脂毒性會(huì)引起免疫炎癥異常，而后者又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)脂代謝紊亂。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)作為血脂代謝紊亂的主要血管并發(fā)癥，血液中脂質(zhì)等物質(zhì)沉積，并伴隨內(nèi)膜受損、炎癥細(xì)胞及因子積聚等一系列病變，最終因脂質(zhì)條紋或斑塊等的形成，導(dǎo)致管腔形態(tài)的病變等。AS也是脂代謝

2、紊亂與免疫炎癥相互促進(jìn)的典型代表，血脂異常是其發(fā)病的關(guān)鍵因素。
　　T、B淋巴細(xì)胞是免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞成分，分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，它們?cè)诿庖哐装Y中發(fā)揮著重要的作用，起著執(zhí)行者以及調(diào)控者的作用，T、B淋巴細(xì)胞在脂代謝紊亂造成的免疫炎癥中發(fā)揮著重要作用，與AS的發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)。盡管大量的臨床及基礎(chǔ)研究證實(shí)在AS的不同階段存在有不同亞型的T細(xì)胞以發(fā)揮不同功能的形式參與了疾病的進(jìn)程，不同的B細(xì)胞亞群對(duì)AS也具有不同的作用，但就目

3、前而言，T細(xì)胞和B細(xì)胞在AS中發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍未完全闡明，尤其是T細(xì)胞免疫反應(yīng)如何在AS中啟動(dòng)并調(diào)控這一精確的機(jī)制、B細(xì)胞如何影響AS、B-2B細(xì)胞是否通過(guò)分泌免疫球蛋G(Immunoglobulin G，IgG)來(lái)影響AS等仍然了解很少，而這一啟動(dòng)和調(diào)控過(guò)程中所涉及的T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群越多，機(jī)制就越復(fù)雜。造成這一復(fù)雜現(xiàn)象的原因可能是T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群的多樣性以及T細(xì)胞（抗原）受體(T cell receptor，TCR)和B細(xì)胞（

4、抗原）受體(B cell receptor,BCR)區(qū)域的多變性。因此，研究AS斑塊中T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫組庫(kù)可以進(jìn)一步揭示其在動(dòng)脈硬化中的發(fā)病機(jī)制。
　　免疫組庫(kù)(Immune repertoire，IR)是任何給定時(shí)間內(nèi)，個(gè)體循環(huán)系統(tǒng)中具有功能多樣性的T細(xì)胞克隆和B細(xì)胞克隆總和。當(dāng)發(fā)生某種特異性免疫應(yīng)答時(shí)，T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫組庫(kù)多樣性降低，出現(xiàn)單一、寡或多克隆數(shù)的升高。以高通量測(cè)序?yàn)檠芯渴侄蔚拿庖呓M庫(kù)測(cè)序(Immune repe

5、rtoire sequencing，IR-SEQ)為研究免疫組庫(kù)的多樣性和可變性提供了可能。下一代測(cè)序(Next generation sequencing，NGS)較高的靈敏度、特異性以及準(zhǔn)確性也為免疫組庫(kù)研究提供了更高的可靠性。
　　本研究將有助于深入理解T細(xì)胞和B細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中的作用，為揭示AS中炎癥免疫異常的機(jī)制提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　研究動(dòng)脈粥樣硬化患者斑塊與正常人外周血T細(xì)胞免疫

6、組庫(kù)和B細(xì)胞免疫組庫(kù)中包括克隆頻率、互補(bǔ)決定區(qū)3(Complementarity determining regions3，CDR3)功能區(qū)氨基酸長(zhǎng)度、公共克隆的分布特征以及V/D/J基因利用率等的變化，從而在DNA單堿基水平上揭示AS患者斑塊內(nèi)細(xì)胞克隆的組成和變化，為研究AS發(fā)病機(jī)制提供更為詳細(xì)的證據(jù)。
　　方法:
　　1收取正常對(duì)照組外周血56例，納入標(biāo)準(zhǔn)為臨床表現(xiàn)為無(wú)典型心絞痛和心電圖改變的正常受試人員，年齡均≥40歲

7、。正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)利用密度梯度離心法提取。AS斑塊組織樣品4例，取自尸檢標(biāo)本和具有AS特征的斑塊標(biāo)本。
　　2天根基因組提取試劑盒，利用離心柱法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞以及組織樣品基因組DNA。每組gDNA提取后，各取等量gDNA混合在一起，形成正常組外周血組樣品池和AS斑塊組樣本池。
　　3根據(jù)所測(cè)DNA濃度及質(zhì)量計(jì)算最適DNA樣品取用量

8、。加入正、反引物，QIAGEN multiplex PCR Kit進(jìn)行多重PCR用于捕獲CDR3區(qū)域。QIAquick PCR Purification Kit對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，而后在經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、接頭連接等建庫(kù)步驟，完成文庫(kù)的構(gòu)建。最后通過(guò)檢測(cè)插入片段范圍和濃度定量的方法對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行評(píng)估。
　　4上一步檢驗(yàn)合格的文庫(kù)，預(yù)算上機(jī)的數(shù)據(jù)量，按比例稀釋到預(yù)定的濃度。將稀釋好的DNA文庫(kù)加入到Flowcell內(nèi)，進(jìn)行橋式PCR

9、擴(kuò)增，然后測(cè)序。
　　5分析軟件miXCR將過(guò)濾后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)，分析不同CDR3序列以及這類(lèi)數(shù)據(jù)提供的克隆表達(dá)情況，同時(shí)鑒定出包括CDR3區(qū)域的氨基酸序列及相對(duì)應(yīng)的克隆讀數(shù)，以及V/D/J基因數(shù)目和頻率。此外，自寫(xiě)腳本和Microsoft Excel2010軟件分析頻率區(qū)間分布、累積頻率分布以及V/D/J基因利用率等。
　　6將實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Microsoft Excel2010和GraphPa

10、d Prism5數(shù)據(jù)分析軟件。采用平均值±SEM，在后期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)比較中，我們采用雙尾t檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1T細(xì)胞克隆頻率比較
　　與對(duì)照組健康受試者外周血內(nèi)前100位克隆頻率相比，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的前100位克隆頻率明顯升高。對(duì)兩組樣本池分析發(fā)現(xiàn)，在克隆相對(duì)低頻區(qū)間內(nèi)，健康受試者外周血在對(duì)應(yīng)的區(qū)間內(nèi)特異性克隆數(shù)目明顯高于AS斑塊組。在高頻區(qū)間內(nèi)(0.006-0.04)AS斑塊

11、組的特異克隆數(shù)目要比健康受試者明顯增多。獨(dú)立樣本累積頻率有類(lèi)似的結(jié)果。
　　2T細(xì)胞克隆長(zhǎng)度分析
　　健康受試者和AS斑塊組的單個(gè)樣品中，T細(xì)胞克隆氨基酸長(zhǎng)度分布差異不顯著，總體分布趨于一致，14、15氨基酸長(zhǎng)度的CDR3序列最多，約占50％。
　　3共同T細(xì)胞克隆比例分布分析
　　與健康受試者的外周血相比，動(dòng)脈粥樣斑塊中的共同克隆或稱(chēng)公共克?。▋蓚€(gè)以上受試者都存在的克?。┍壤黠@升高，平均比例為0.38，而健康

12、受試者平均比例約為0.23。對(duì)兩組的3個(gè)受試者的共同的克隆進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，特異克隆中的共同克隆的比例在斑塊組明顯高于健康受試者組，相應(yīng)的在所有克隆中的公共克隆的比例也是在斑塊組明顯升高。
　　4V基因和J基因利用率分析
　　斑塊T細(xì)胞庫(kù)中某些的V基因、J基因利用率明顯高于健康受試者組，比如TRBV20-1，TRBJ2-5，TRBJ2-1。推測(cè)可能有共同抗原或病理刺激。
　　5B細(xì)胞克隆頻率比較
　　與健康受試者

13、外周血的前100位B細(xì)胞克隆頻率相比，AS斑塊的前100位克隆頻率明顯升高，＞0.1％頻率區(qū)間內(nèi)AS斑塊組B細(xì)胞克隆數(shù)比例高于健康受試者外周血組。
　　6B細(xì)胞受體CDR3區(qū)克隆長(zhǎng)度分布
　　動(dòng)脈粥樣斑塊組相對(duì)于健康受試者組，動(dòng)脈粥樣斑塊組中某些長(zhǎng)度如(15、16、17、18和20)個(gè)氨基酸的B細(xì)胞克隆頻率高于健康受試者組。
　　7分析B細(xì)胞克隆VJ基因利用率
　　斑塊B細(xì)胞庫(kù)中的V-J基因利用率（V-J基因類(lèi)型

14、）與健康受試者組相比減少，但是B細(xì)胞高頻克隆增加，比如V3-21-J4，V3-23-J4。在斑塊BCR庫(kù)中某些的V基因和J基因利用率明顯不同于健康受試者外周血(NPB)，比如:IGHV3-21,IGHV3-23,IGHV3-33,IGHJ4。
　　結(jié)論:
　　1.與健康受試者相比，AS患者斑塊內(nèi)T細(xì)胞和B細(xì)胞高頻克隆數(shù)增加。
　　2.與健康受試者相比，AS斑塊組的T細(xì)胞共同克隆比例升高。
　　3.AS斑塊與正常受