T細(xì)胞亞群在淋巴細(xì)胞性胸腔積液中的免疫學(xué)特征.pdf

1、正常臟層和壁層胸膜構(gòu)成的閉合腔隙內(nèi)有一層稀薄的漿膜腔液,稱為胸膜腔液,在呼吸運(yùn)動(dòng)中起著潤(rùn)滑的作用,其生成與吸收處于相對(duì)恒定的動(dòng)態(tài)平衡當(dāng)中。當(dāng)胸膜受到惡性腫瘤侵犯或病原體感染等病理狀態(tài)下,存在胸膜和血管通透性增加、壁層胸膜淋巴管堵塞等因素,從而導(dǎo)致胸膜腔液生成過(guò)快和(或)吸收減緩,過(guò)多的富含蛋白質(zhì)和細(xì)胞成分的滲出液積聚于胸膜腔,便形成了胸腔積液。胸腔積液是臨床上常見(jiàn)的疾病或并發(fā)癥,但由于長(zhǎng)期較少受到學(xué)界的重視,至今為止,從其免疫發(fā)病學(xué)機(jī)制

2、到臨床診療處理等方面仍存在諸多問(wèn)題有待闡明。胸腔積液疾病中,以淋巴細(xì)胞性胸腔積液占的比重較大,其是指胸腔積液中淋巴細(xì)胞的數(shù)量占白細(xì)胞總數(shù)的50％以上,惡性腫瘤和結(jié)核性胸膜炎是其主要的病因,約占90%以上。惡性胸腔積液是多種惡性腫瘤尤其是肺癌晚期發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移的結(jié)果,因缺乏有效治療手段因而預(yù)后甚差,其中位生存期僅4—6月;結(jié)核性胸腔積液是結(jié)核病的其中一種類型,雖然是可治療的疾病,然而隨著免疫相關(guān)性疾病患病率增加、多重耐藥性結(jié)核桿菌感染增多等

3、因素的出現(xiàn),目前仍然屬于醫(yī)療、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重的多發(fā)病。
　　淋巴細(xì)胞性胸腔積液中的細(xì)胞成分以T淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì),其中又以CD4+的輔助性T(HelperTcell,Th)細(xì)胞為主。Th細(xì)胞是貫通固有免疫和獲得性免疫的橋梁,在機(jī)體免疫反應(yīng)的啟動(dòng)和維持中扮演核心角色。自從二十多年前發(fā)現(xiàn)Th1和Th2細(xì)胞以來(lái),至今已有多個(gè)新的Th亞群被陸續(xù)地發(fā)現(xiàn),包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、IL-17分泌性Th細(xì)胞(Th17)、Th9、Th22等。

4、它們是受到不同的疾病免疫微環(huán)境刺激后,從初始(Na?ve)CD4+T細(xì)胞分化而來(lái),并具有各自的獨(dú)特生物學(xué)功能特征,介導(dǎo)著截然各異的免疫學(xué)效應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于這些新型Th亞群在淋巴細(xì)胞性胸腔積液中的的表型和免疫學(xué)活性研究甚少。
　　因此,本系列研究瞄準(zhǔn)國(guó)際前沿領(lǐng)域,對(duì)這些T細(xì)胞亞群的生物學(xué)特征、所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、以及如何參與胸膜疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制展開(kāi)了研究。除了加深人們對(duì)這些重要的T細(xì)胞亞群免疫學(xué)特性的認(rèn)識(shí)、從嶄新的角度出發(fā)來(lái)闡明胸

5、膜疾病的發(fā)病學(xué)機(jī)制之外,還為臨床更好地控制腫瘤性和感染性疾病提供了新的干預(yù)途徑和理論依據(jù)。本論文的系列研究圍繞著T細(xì)胞亞群在淋巴性胸腔積液中的免疫學(xué)特征,總共展開(kāi)了6部分研究:
　　第一部分白細(xì)胞介素-17分泌性CD4+T淋巴細(xì)胞在惡性胸腔積液中的發(fā)生和分化機(jī)制
　　目前已知,分泌白介素(IL)-17的輔助性T淋巴(Th17)細(xì)胞在人類的某些惡性腫瘤環(huán)境中顯著增多。但人們對(duì)于惡性胸腔積液(MPE)中的Th17細(xì)胞調(diào)節(jié)抗腫瘤免

6、疫的機(jī)制仍知之甚少。在本部分研究中,我們采用流式細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光雙染法,探討了Th17在肺癌轉(zhuǎn)移所致胸腔積液患者的MPE及外周血中的分布、表型特點(diǎn),同時(shí)探討了細(xì)胞因子對(duì)Th17細(xì)胞發(fā)生和分化的影響,以及趨化因子CCL20和CCL22對(duì)Th17的體外趨化活性的影響。研究結(jié)果顯示,與外周血相比,MPE中的Th17細(xì)胞的數(shù)量顯著增多。體外研究發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6、IL-23、以及它們的各種組合均能夠促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞定

7、向分化。在體外趨化實(shí)驗(yàn)中可觀察到,MPE對(duì)Th17細(xì)胞具有趨化活性,此種趨化性可被抗CCL20或/和抗CCL22單克隆抗體部分阻斷。研究數(shù)據(jù)還顯示,MPE中Th17細(xì)胞的聚集預(yù)示患者預(yù)后有所改善。因此,MPE中Th17細(xì)胞增多的原因可能在于胸膜腔內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子對(duì)Th17細(xì)胞定向分化和擴(kuò)增起到刺激作用,胸膜腔內(nèi)的趨化因子CCL20和CCL22對(duì)可以募集外周血Th17細(xì)胞浸潤(rùn)到胸膜腔。本部分研究提示,在腫瘤疾病中針對(duì)對(duì)Th17細(xì)胞亞群進(jìn)

8、行調(diào)控和增強(qiáng)免疫的策略,可有助于延長(zhǎng)晚期癌癥患者的生存時(shí)間。
　　第二部分惡性胸腔積液中的CD39+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)LAP依賴性途徑抑制Th17細(xì)胞發(fā)生和分化過(guò)程
　　現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和IL-17分泌性輔助性T(Th17)細(xì)胞均參與了人類惡性腫瘤疾病的發(fā)生,然而對(duì)于惡性胸腔積液(MPE)中Tregs對(duì)Th17細(xì)胞發(fā)生分化的調(diào)節(jié)卻研究甚少。在本部分研究中,我們采用了流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺癌患者M(jìn)PE和外周血中

9、CD39+Tregs和Th17細(xì)胞數(shù)量,同時(shí)研究Tregs對(duì)Th17細(xì)胞發(fā)生分化過(guò)程的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果顯示,與外周血相比,MPE中CD39+Tregs和Th17細(xì)胞數(shù)量均顯著增多,并且這兩個(gè)細(xì)胞亞群數(shù)量之間呈負(fù)相關(guān)。MPE中IL-1β,IL-6和TGF-β濃度亦高于相應(yīng)的同源外周血清,MPE中CD39+Tregs表面能夠表達(dá)潛在型結(jié)合肽(Latencyassociatedpeptide,LAP)。CD39+Tregs可抑制初始CD4+

10、T細(xì)胞向Th17細(xì)胞定向分化,這種抑制效應(yīng)隨這CD39+Tregs數(shù)量增多而增強(qiáng),當(dāng)加入LAP阻斷抗體后CD39+Tregs介導(dǎo)的抑制效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。本部分研究提示,CD39+Tregs可以通過(guò)LAP依賴性途徑抑制Th17細(xì)胞的發(fā)生和分化過(guò)程。
　　第三部分結(jié)核性胸膜炎中的胸膜間皮細(xì)胞促進(jìn)IL-22分泌性CD4+T細(xì)胞的分化和募集
　　根據(jù)研究報(bào)道,IL-22分泌性輔助性T(Th22)細(xì)胞參與了結(jié)核桿菌感染的免疫反應(yīng)。然而關(guān)于結(jié)

11、核性胸腔積液(TPE)中Th22細(xì)胞的分化與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確,本部分研究旨在闡明Th22細(xì)胞分化及其向胸腔浸潤(rùn)的機(jī)制,以及與胸膜間皮細(xì)胞之間的相互免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。我們檢測(cè)了TPE和外周血中Th22細(xì)胞的分布及表型,探討了促炎性細(xì)胞因子以及胸膜間皮細(xì)胞(PMCs)的抗原提呈作用對(duì)Th22細(xì)胞定向分化過(guò)程的影響,同時(shí)研究了PMCs分泌的趨化因子對(duì)Th22細(xì)胞的趨化活性。本部分研究結(jié)果顯示,TPE中Th22細(xì)胞數(shù)量較外周血中明顯地增高。IL

12、-1β,IL-6,和/或TNF-α能夠促進(jìn)CD4+T定向分化為T(mén)h22細(xì)胞。PMCs可表達(dá)CCL20,CCL22,和CCL27,TPE以及PMC培養(yǎng)上清能夠募集外周血中的Th22細(xì)胞浸潤(rùn)到胸膜腔,此趨化效應(yīng)可被抗–CCL20,–CCL22,和–CCL27中和抗體部分阻斷。IL-22和IL-17可以顯著地促進(jìn)PMCs的損傷修復(fù)。另外,PMCs能夠通過(guò)提呈結(jié)核特異性抗原,促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖及Th22細(xì)胞的發(fā)生分化。因此,本部分研究提示,

13、胸膜腔中的細(xì)胞因子以及PMCs分泌的趨化因子可能是引起TPE中Th22細(xì)胞數(shù)量增多的原因,TPE中PMCs與Th22細(xì)胞間存在協(xié)同關(guān)系。PMCs是一種新型的抗原提呈細(xì)胞,能夠刺激CD4+T細(xì)胞增殖并且分化為T(mén)h22細(xì)胞。
　　第四部分惡性胸腔積液中的IL-22分泌性CD4+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用
　　根據(jù)研究報(bào)道,Th22細(xì)胞與人類癌癥的發(fā)病過(guò)程有關(guān),然而惡性胸腔積液(MPE)中Th22細(xì)胞的分化和免疫調(diào)節(jié)尚不為人知。本部分研

14、究發(fā)現(xiàn),MPE中Th22細(xì)胞增多,并且其分泌的IL-22能夠顯著促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡、促進(jìn)其向胸膜組織方向遷移,IL-22還增強(qiáng)A549細(xì)胞與胸膜間皮細(xì)胞層的相互粘附。本部分研究提示,Th22細(xì)胞在胸腔細(xì)胞因子和趨化因子的共同作用下募集浸潤(rùn)胸膜腔,其在人類惡性胸腔積液環(huán)境中對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　第五部分結(jié)核性胸膜炎中的胸膜間皮細(xì)胞促進(jìn)Th9細(xì)胞分化和募集
　　最新發(fā)現(xiàn)的IL-9分泌性CD4+

15、T(Th9)細(xì)胞參與了組織炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答,但Th9細(xì)胞在結(jié)核病中的分化和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。本部分研究結(jié)果顯示,相對(duì)于外周血而言,結(jié)核性胸腔積液(TPE)中Th9細(xì)胞數(shù)量明顯增高,具有效應(yīng)性細(xì)胞的表型特征。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGF-β在初始CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h9細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,并而聯(lián)合IL-1β,IL-4或IL-6可以進(jìn)一步促進(jìn)Th9細(xì)胞的分化。TPE和PMCs培養(yǎng)上清對(duì)Th9細(xì)胞具有趨化活性,而抗–CCL20中和抗體可以

16、部分阻斷此趨化效應(yīng)。IL-9具有促進(jìn)胸膜間皮細(xì)胞損傷修復(fù),抑制IFN-γ誘導(dǎo)的胸膜間皮細(xì)胞凋亡的作用。此外,胸膜間皮細(xì)胞能夠通過(guò)遞呈抗原促進(jìn)Th9細(xì)胞定向分化。本部分研究揭示了Th9細(xì)胞新的功能特征,尤其是結(jié)核感染人體時(shí)Th9細(xì)胞與胸膜間皮細(xì)胞之間的免疫調(diào)節(jié)協(xié)同作用。值得一提的是,胸膜間皮細(xì)胞可作為抗原提呈細(xì)胞,促進(jìn)Th9細(xì)胞分化。
　　第六部分惡性胸腔積液中IL-9分泌性CD4+T細(xì)胞的分化和免疫調(diào)節(jié)作用
　　據(jù)報(bào)道稱,I

17、L-9分泌性CD4+T(Th9)細(xì)胞與炎癥反應(yīng)和免疫疾病密切相關(guān),然而Th9細(xì)胞與惡性疾病的關(guān)系尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本部分研究旨在闡明惡性胸腔積液(MPE)中Th9細(xì)胞的分化機(jī)制,揭示其對(duì)肺癌細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。我們檢測(cè)了MPE和外周血中Th9細(xì)胞的比例,及其與Th1、Th17細(xì)胞之間的相關(guān)關(guān)系。探索了促炎細(xì)胞因子以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)在體外對(duì)Th9細(xì)胞分化過(guò)程的影響及機(jī)制。同時(shí)探討了IL-9、IL-17和IFN-γ對(duì)肺癌細(xì)胞的

18、作用以及其過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本部分研究結(jié)果顯示,MPE中Th9、Th17和Th1細(xì)胞比例均較外周血明顯增高,而MPE中Th9細(xì)胞數(shù)量增多的原因可能在于局部促炎細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的促進(jìn)作用。IL-9和IL-17通過(guò)激活STAT3通路,顯著地促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和遷移,而IFN-γ則通過(guò)激活STAT1抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移,并誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。此外,IL-9和IFN-γ顯著地促進(jìn)肺癌細(xì)胞與胸膜間皮細(xì)胞層之間的相互粘附,而IL-17