老老年高血壓病中醫(yī)證候流行病學特征及LncRNA表達譜研究.pdf

1、原發(fā)性高血壓是以動脈血壓升高為主要臨床表現(xiàn)的綜合征，影響重要臟器，如心、腦、腎的結構與功能，是多種心腦血管疾病的重要病因、危險因素和主要的死亡原因之一，其發(fā)病機制十分復雜。據(jù)統(tǒng)計我國18歲以上高血壓病患者已達1.6億多，60歲以上老人患有高血壓病患病率50％以上，并且隨著年齡的增長而顯著增加，80歲以上人群高血壓病患病率達70％以上。目前國際將≥80歲的老年人稱為老老年，老老年人群的高血壓病稱之為老老年高血壓病。有效治療老老年高血壓病患

2、者，對于降低心腦血管疾病風險、延長壽命、提高生存質(zhì)量和減少死亡率都具有十分重要的意義。近年來，中醫(yī)對原發(fā)性高血壓的辨證分型與客觀理化指標之間的相關性進行了大量的研究，并取得了一定的成果。但是，目前高血壓病的中醫(yī)證候類型尚未統(tǒng)一，中醫(yī)證候的生物學基礎研究還處在探索階段，需要更深入的研究與實踐。基因芯片技術具有高通量、微型化和自動化的特點，為證候生物學基礎研究提供有力的工具;并且在思維方法上與中醫(yī)學整體觀思想具有的一定的契合。因而基因芯片目

3、前已經(jīng)較為廣泛應用于中醫(yī)藥研究的諸多方面。LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200bp的RNA，位于細胞核內(nèi)或胞質(zhì)中，不參與蛋白質(zhì)編碼功能，以RNA形式在表觀遺傳學上、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多種層面上調(diào)控基因的表達水平。本研究采用LncRNA和mRNA芯片技術，檢測老老年高血壓病患者LncRNAs與mRNA表達特點及其在高血壓病患者各個中醫(yī)證候之間的表達差異。LncRNA的研究因為其不確定性而存在困難，無現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫來查找其功能，為解決此問題，我

4、們通過研究與LncRNA相關mRNA關系研究，來間接的確定LncRNA的功能。本研究運用GO分析、KEGG分析，即運用生物信息學分析方法，將網(wǎng)絡和通路相結合，分析差異表達的基因在整個疾病中所起到的調(diào)控作用。
　　目前國內(nèi)對于老老年高血壓病患者中醫(yī)證候的研究還十分缺乏。本課題采用流行病學方法對老老年高血壓病患者一般情況及中醫(yī)臨床癥狀進行全面采集，以期能進一步了解老老年高血壓病患者的證候分布特征，為老老年高血壓病患者的中醫(yī)臨床診治提供

5、依據(jù)。在LncRNA水平探討高血壓病的內(nèi)在機制和中醫(yī)證候的生物學基礎，從而為老老年高血壓病中醫(yī)證候的生物學基礎研究提供依據(jù)、奠定基礎。
　　1、目的
　　研究老老年原發(fā)性高血壓患者的中醫(yī)證候分布情況，及不同中醫(yī)證候各臨床理化指標之間的差異;檢測老老年高血壓病患者LncRNAs與mRNA表達特點及其在各個中醫(yī)證候之間的表達差異;為老老年高血壓病患者的證候的臨床診斷及治療提供更多的生物學證據(jù)，在LncRNA層面初步探索高血壓病的

6、發(fā)病機制及不同中醫(yī)證候的生物學基礎。
　　2、方法
　　2.1臨床資料的收集
　　應用流行病學調(diào)查方法，全面收集老老年高血壓病患者的臨床癥狀，選取出現(xiàn)頻率＞10％的癥狀，通過因子分析法提取證素，再對提取的公因子運用聚類分析法，總結出老老年原發(fā)性高血壓患者中醫(yī)主要證候分型;并進一步對老老年高血壓病患者不同中醫(yī)證候分型之間動態(tài)血壓、動態(tài)心電圖、頸部超聲及生化指標等內(nèi)容進行比較，探索其中的差異。
　　2.2實驗研究方法

7、
　　選取具有以上中醫(yī)證候分型特征的老老年高血壓病患者，每組5例，共25例;健康人5例，采集靜脈血，提取外周單核細胞的總RNA，應用晶芯LncRNA+mRNA表達譜芯片，檢測老老年高血壓病組與健康組LncRNA、mRNA表達差異，同時檢測老老年高血壓病不同證候之間的LncRNA、mRNA表達差異，應用GO、KEGG分析方法初步分析差異基因的功能。運用基因共表達方法和靶基因的預測，得出老老年高血壓病和其不同中醫(yī)證候的關鍵LncRNA

8、s。
　　2.3統(tǒng)計學方法
　　數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析，中醫(yī)癥狀頻數(shù)統(tǒng)計采用頻數(shù)分析法，中醫(yī)證素、證候分布情況情況采用因子分析及聚類分析方法進行統(tǒng)計。計量資料用均數(shù)±標準差((x)±SD)表示;多組間計量資料比較時，若不符合正態(tài)分布，采用Kruskal.Wallis秩和檢驗;若符合正念分布，采用Levene'S檢驗判斷方差是否具有齊性，滿足方差齊性采用單因素方差分析;若方差不齊則采用Kruskal.Wall

9、is秩和檢驗;計數(shù)資料采用卡方檢驗;均p≤0.05為差異有統(tǒng)計。采用excel-2013軟件繪制圖。差異基因的分析，使用Agilent FeatureExtraction(v10.7)軟件對雜交圖片進行分析并提取數(shù)據(jù);然后使用Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析。運用聚類軟件Cluster3.0進行average-linkage層次聚類運算;根據(jù)聚類結果，在Java環(huán)境下，運行TreeView軟件繪制熱圖。

10、GO分析、KEGG分析運用博奧公司mas系統(tǒng)得出。應用Cytoscape軟件生成基因相關網(wǎng)絡圖。
　　3、結果
　　3.1老老年高血壓病患者中醫(yī)證候特征
　　總共納入357例老老年高血壓病患者，經(jīng)流行病學調(diào)查，因子分析顯示共分成9個公因子，分別為F1-F9;病位證素:心肝腎同病(9％);心肝同病(4％);心(10％);腎(8％);脾腎同病(31％);肝腎同病(33％);肝(5％)。病性證素:陰虛+氣虛(8.68％);痰

11、濁+氣滯+血瘀+陽亢(16.25％);陽虛+血瘀(10.08％);陰虛+痰濁+濕困(6.16％);氣滯+血瘀(7.56％);痰濁+血瘀(22.69％);水停+痰濁(14.85％);血瘀+氣虛(9.52％);痰濁+血瘀+氣滯(4.21％)。將該9個公因子進行聚類分析，將老老年原發(fā)性高血壓患者可以歸為五類，即第一類:肝腎陰虛兼氣虛血瘀(19.05％);第二類:肝陽上亢兼痰濕內(nèi)阻(24.93％);第三類:氣虛血瘀(9.52％);第四類:陰陽兩

12、虛兼氣滯痰瘀(38.94％);第五類:痰瘀互阻(7.56％)。將這五類證候患者的臨床理化指標進行比較發(fā)現(xiàn)，動態(tài)血壓參數(shù)、心率變異性、頸動脈內(nèi)中膜厚度、生化指標、血常規(guī)指標、甲狀腺功能、腎素水平、同型半胱氨酸等理化指標在各證候之間存在諸多差異。
　　3.2老老年高血壓病患者LncRNA表達譜分析
　　LncRNA+mRNA表達譜芯片分析結果顯示“老老年高血壓病”與“健康人”組比較，LncRNA、mRNA表達均存在明顯差異，“老

13、老年高血壓病”與“健康人”組比較差異表達的mRNA廣泛富集于細胞組件、生物進程、分析功能途徑的多方面，KEGG分析顯示:“老老年高血壓病”vs“健康”組上調(diào)表達的mRNA富集于Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection、Toll-likereceptor signaling pathway、 Asthma、 Allograft rejection、Graft-ve

14、rsus-host disease、Bladder cancer、TypeⅠ diabetes mellitus、Cytokine-cytokine receptor interaction等20個通路有關;下調(diào)的基因富集于6條通路，分別是:Systemic lupus erythematosus、Antigen processing andpresentation、 Natural killer cell mediated cytot

15、oxicity、Graft-versus-host disease、Glycine, serine and threonine metabolism、ABCtransporters-General通路，這些通路與炎癥、免疫應答等機制存在顯著聯(lián)系。
　　3.3老老年高血壓病不同中醫(yī)證候靶基因預測
　　老老年高血壓病各證候間比較，存在大量差異表達的LncRNA、mRNA;差異表達的mRNA在細胞組件、生物進程、分析功能方面廣泛富

16、集。其中KEGG通路比較，不同證候富集通路存在共性和差異，這為老老年高血壓病不同證候的存在提供了客觀的依據(jù)，同時也指出了研究方向。
　　運用差異表達的基因，經(jīng)基因共表達與靶基因預測分析發(fā)現(xiàn)，老老年高血壓病不同中醫(yī)證候的靶基因如下:老老年高血壓病中CTD-2369P2.8、CTB-61M7.2為關鍵上調(diào)LncRNA;ENST00000424181.1為關鍵下調(diào)基因。老老年高血壓病“肝腎陰虛兼氣虛血瘀”證候中:ENST00000505

17、155.1、ENST00000420417.3、CTD-2369P2.8、TCONS_00010443、ENST00000435554.1、ENST00000457303.3、ENST00000505564.2、CTB-61M7.2、ENST00000435554.1、ENST00000505564.2、ENST00000453832.2為關鍵上調(diào)的LncRNA，uc021wqv.1、CTD-2012I17.1、ZNF718、TCONS

18、_00026226、TCONS_00022737、ENST00000424181.1為關鍵下調(diào)的LncRNA;“肝陽上亢兼痰濕內(nèi)阻”證候:CTD-2369P2.8、XXbac-BPG254F23.6為關鍵上調(diào)的LncRNA，ENST00000424181.1為關鍵下調(diào)的LncRNA;“氣虛血瘀”證中:ENST00000589217.1為關鍵上調(diào)LncRNA，ENST00000424181.1為關鍵下調(diào)的LncRNA;“陰陽兩虛兼氣滯痰瘀

19、”證候:CTD-2369P2.8、HIT000092395_03、HIT000095414_04為關鍵上調(diào)LncRNA; XR_171093.1、TCONS_00010987、ENST00000595309.1、ENST00000513626.1、ENST00000424181.1為關鍵下調(diào)LncRNA;“痰瘀互阻”證候:ENST00000457239.1、ENST00000455707.1、CTD-2369P2.8、ENST00000

20、432452.1、ENST00000449954.1、CTB-61M7.2為關鍵上調(diào)LncRNA，HIT000326149、ENST00000424181.1為關鍵下調(diào)LncRNA。但目前有關LncRNA的研究相對缺乏，上述基因的功能研究較少。
　　4、結論
　　4.1老老年高血壓病患者伴隨疾病多、臨床癥狀十分復雜，證候特征以虛實夾雜為主，單一證素少見，多數(shù)為為多個證素組成的復雜證候;通過因子分析和聚類分析相結合得出:肝腎陰

21、虛兼氣虛血瘀、肝陽上亢兼痰濕、氣虛血瘀、陰陽兩虛兼氣滯痰瘀、痰瘀互阻為老老年高血壓病的主要證候。
　　4.2老老年高血壓病患者不同中醫(yī)證候動態(tài)血壓參數(shù)、心率變異性、頸動脈內(nèi)中膜厚度、生化指標、血常規(guī)指標、甲狀腺功能、腎素水平等理化指標之間存在差異;為老老年高血壓病患者生物學基礎提供了依據(jù)。
　　4.3本研究通過對老老年高血壓病患者與健康對照組LncRNA和mRNA的研究，找到老老年高血壓病及老老年高血壓病不同中醫(yī)證候差異表達