仔母豬生殖細(xì)胞數(shù)性狀解析與in silico基因表達(dá)研究.pdf

1、在人類(lèi)，生育延遲成為目前一個(gè)重要的社會(huì)變化，由于生殖老化現(xiàn)象的普遍存在，也就導(dǎo)致了逐漸增長(zhǎng)的難育或不育的發(fā)生，這在具有較高學(xué)歷的女性群體尤為明顯。在其他動(dòng)物，也體現(xiàn)相似的繁殖力年齡依賴(lài)性下降，如果能明確動(dòng)物的繁殖力變化過(guò)程，將極大地造福于人類(lèi)。然而，由于倫理道德或其他因素，在人類(lèi)生殖老化方面進(jìn)行直接的、廣泛的研究是不可行的，所以只有利用動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行研究，從而將相關(guān)理論、機(jī)制轉(zhuǎn)移到人類(lèi)。母豬也有隨著年齡的增加而出現(xiàn)繁殖能力下降的趨勢(shì)，但

2、在養(yǎng)豬業(yè)上，目前還未重視這個(gè)問(wèn)題，更沒(méi)人將其與雌性生殖老化聯(lián)系起來(lái)。 目前對(duì)引起生殖老化的原因仍有爭(zhēng)議，但普遍認(rèn)為雌性生育能力年齡相關(guān)性下降的生物學(xué)基礎(chǔ)主要包括：生殖細(xì)胞得不到補(bǔ)充，出生后至停止生育過(guò)程中卵子的損耗和利用，以及老化造成的卵子質(zhì)量衰退等。可見(jiàn)，雌性生殖老化現(xiàn)象與生殖細(xì)胞數(shù)的下降息息相關(guān)。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，新生的雌性個(gè)體就已擁有最大數(shù)目的生殖細(xì)胞，即個(gè)體在胎兒期已建立其生殖細(xì)胞儲(chǔ)備庫(kù)，而且這種有限的儲(chǔ)備必須服務(wù)于整

3、個(gè)生育期。然而，隨著個(gè)體年齡的增長(zhǎng)，由于募集排卵和卵泡閉鎖，這個(gè)數(shù)目在整個(gè)生命期間穩(wěn)定地縮減，直到最終的完全耗竭。在生殖細(xì)胞發(fā)育方面，豬和人具有相似的發(fā)育變化模式。所以本研究選擇杜洛克×梅山(DM)雜種仔母豬和PIC×長(zhǎng)大(PLL)PLL雜種仔母豬，對(duì)仔豬早期生長(zhǎng)階段生殖細(xì)胞數(shù)性狀的變化模式和分子基礎(chǔ)進(jìn)行初步分析。 我們用膠原酶(I型)消化仔豬卵巢，將卵巢生殖細(xì)胞與其它細(xì)胞或粘連組織分離開(kāi)來(lái)，而且很容易辨別。然后在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)每

4、個(gè)卵巢的生殖細(xì)胞數(shù)量，從而分析生殖細(xì)胞數(shù)與卵巢性狀和繁育性能的關(guān)系。結(jié)果表明：仔母豬生殖細(xì)胞數(shù)與卵巢重量、仔豬胎次以及窩產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系不大(P>0.05)；仔豬生殖細(xì)胞數(shù)與去勢(shì)日齡存在顯著負(fù)相關(guān)，兩豬群相關(guān)系數(shù)分別為R=-0.451(P<0.05)和R=-0.451(P<0.05)。隨著個(gè)體年齡的增加，生殖細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)，在仔豬早期生長(zhǎng)發(fā)育階段表現(xiàn)是很明顯的，這與其它物種的現(xiàn)象存在一致性；生殖細(xì)胞數(shù)存在品種問(wèn)差異，在同一生長(zhǎng)發(fā)育

5、時(shí)期，兩豬群生殖細(xì)胞數(shù)存在顯著差異，DM豬群顯著高于PLL豬群(P<0.05)a接著，我們?cè)诖罅柯殉采臣?xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)上，分別在兩豬群相同發(fā)育階段選擇高、低生殖細(xì)胞數(shù)(各10個(gè))卵巢(各10個(gè))并提取其基因組DNA形成4個(gè)代表生殖細(xì)胞數(shù)高、低性狀的池DNA樣品，然后進(jìn)行AFLP分析和差異條帶的克隆分析。用試劑盒提供的8種E端引物和8種M端引物，共64種引物組合對(duì)各池DNA樣品進(jìn)行選擇擴(kuò)增，得到了適度的多態(tài)性。通過(guò)這種．AFLP技術(shù)結(jié)合

6、BSA法的現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)，我們成功篩選到了與仔豬生殖細(xì)胞數(shù)高/低性狀連鎖的分子標(biāo)記，并對(duì)三個(gè)代表豬生殖細(xì)胞數(shù)性狀差異的多態(tài)性片段進(jìn)行了克隆測(cè)序分析，A、B、C片段長(zhǎng)度分別為374bp，254bp和377bp。 在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)室研究工作的同時(shí)，我們也嘗試用新的方式來(lái)分析生命科學(xué)領(lǐng)域的問(wèn)題，因?yàn)槿藗儗?duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)過(guò)程和方式在發(fā)展、轉(zhuǎn)變，尤其是隨著大量實(shí)驗(yàn)室研究工作的進(jìn)行，原始資料的進(jìn)一步積累，信息技術(shù)的不斷進(jìn)步，宏觀的思維，綜合

7、、計(jì)算的方式，快捷的方法便成為必要和必然。 人類(lèi)基因組草圖的公布以及對(duì)其序列的初步注釋?zhuān)ǔ１槐茸鳌包S金通道”而為我們開(kāi)展各種各樣的生物學(xué)研究提供豐富的數(shù)據(jù)資源，NCBI人類(lèi)基因組資源表明：在跨越約超過(guò)3,000M堿基序列中包含26,000-39,000個(gè)基因，這些序列資源無(wú)疑將為我們開(kāi)展in silico研究提供基石和參照；同時(shí)，全球范圍內(nèi)對(duì)各種生物基因組計(jì)劃的開(kāi)展，導(dǎo)致了大量序列數(shù)據(jù)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)迅速蓄積，尤其是表達(dá)序列標(biāo)簽序

8、列，目前有超過(guò)100,000豬ESTs序列存儲(chǔ)于公共數(shù)據(jù)庫(kù)，這些序列無(wú)疑將為新基因的發(fā)現(xiàn)、同源基因的鑒別、基因的染色體定位及多態(tài)性探測(cè)等研究提供信息與輔助。本研究旨在利用這些數(shù)據(jù)資源開(kāi)展in silico研究：從人類(lèi)基因入手，以一種新的基因定位方式來(lái)注解豬不同組織來(lái)源的ESTs序列，探測(cè)豬一定組織、器官基因表達(dá)狀況，從而快速實(shí)現(xiàn)有用生物信息的轉(zhuǎn)移。 我們以人類(lèi)基因組基因序列作為參照，執(zhí)行Blast搜索開(kāi)采儲(chǔ)于NCBI的豬ESTs

9、序列資源，開(kāi)展in silico研究，通過(guò)同源性鑒別達(dá)到基因表達(dá)模式的識(shí)別。其主要過(guò)程包括：1)收集人類(lèi)基因cDNA序列；2)用所有收集的人類(lèi)基因作為查詢(xún)序列，對(duì)GenBank的Est-others數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)搜索，按一定標(biāo)準(zhǔn)(超過(guò)100bp的連續(xù)序列比對(duì)中，序列同源性高于80％)篩選出高同源的豬EST序列，并按人類(lèi)染色體編號(hào)分類(lèi)豬EST匹配記錄；3)按不同組織來(lái)源對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)的ESTs記錄分類(lèi)，并整理、統(tǒng)計(jì)分析表達(dá)于各組織器

10、官的豬EST數(shù)據(jù)。為完成序列的收集、比對(duì)以及對(duì)結(jié)果的整理，開(kāi)發(fā)了四個(gè)Java程序：1)Web robot，用于探查所有人類(lèi)染色體信息網(wǎng)頁(yè)以收集人類(lèi)基mRNA序列號(hào)；2)Light query，以mRNA序列號(hào)作為搜索域，用于自動(dòng)查詢(xún)NCBI搜索引擎(Entrez)，并以FASTA列格式收集人類(lèi)基因序列；3)Blastfilter，用于濾掉Blast索過(guò)程中不滿足條件的比對(duì)結(jié)果；4)Parser／Screen，用于處理Blast比對(duì)結(jié)果的

11、普通文本，它通過(guò)剖分與篩選，將符合條件的比對(duì)記錄中的匹配長(zhǎng)度、序列相似性，以及關(guān)鍵詞、描述信息等匯集，并整理成Excel格式。利用人類(lèi)33，308個(gè)基因，通過(guò)Blast比對(duì)“est-others”數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到與人類(lèi)基因同源的豬ESTs序列總數(shù)為70,896個(gè)。我們首先探測(cè)了豬脂肪及肌肉組織中基因表達(dá)概況，結(jié)果表明：至少有2,002個(gè)基因在豬脂肪及肌肉組織中表達(dá)，其中1,087個(gè)基因在脂肪組織表達(dá)，1,205個(gè)基因在肌肉組織中表達(dá)，兩組織

12、共同表達(dá)的基因?yàn)?90個(gè)；基礎(chǔ)活性基因114個(gè)(脂肪和肌肉組織分別表達(dá)80和34個(gè))。然后我們也對(duì)豬肝臟、腎臟、脾臟和小腸四大主要內(nèi)臟器官的基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)至少有2，100個(gè)(6.3％)基因表達(dá)于這四個(gè)組織，分別為128(6.10％)，81(3.86％)，780(37.14％)和1，423(67.76％)個(gè)(存在一些組織共表達(dá)基因)，基礎(chǔ)活性基因60個(gè)，分別為6、0、36及18個(gè)。同時(shí)，對(duì)基因表達(dá)模式，如組織共表達(dá)基因，高度