硼替佐米對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:結(jié)腸癌(coloncancer,CR)是世界第三大腫瘤,也是我國(guó)最常見的九大腫瘤之一。由于結(jié)腸癌的發(fā)病因素與社會(huì)環(huán)境、生活方式以及遺傳背景等有關(guān),所以在過(guò)去的20年中結(jié)腸癌患病人數(shù)持續(xù)增加,發(fā)病率不斷升高。結(jié)腸癌還可以引起腸梗阻、腸穿孔等嚴(yán)重的并發(fā)癥,即使經(jīng)過(guò)常規(guī)放化療、手術(shù)等治療,但患者的5年無(wú)病生存率及晚期的生存質(zhì)量并不理想。在早期手術(shù)后,及時(shí)治療以控制疾病發(fā)展,晚期及時(shí)采用藥物化療減少?gòu)?fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,可以提高結(jié)腸癌患者的生存率及

2、晚期的生存質(zhì)量。硼替佐米(Bortezomib)是首個(gè)應(yīng)用于臨床研究的蛋白酶體抑制劑。美國(guó)食品藥物管理局(FDA)在2003年批準(zhǔn)硼替佐米用于治療進(jìn)展期的多發(fā)性骨髓瘤患者。美國(guó)癌癥研究所用60株來(lái)自人類不同腫瘤的細(xì)胞,對(duì)硼替佐米進(jìn)行了藥物試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其能強(qiáng)效地抑制細(xì)胞的增殖能力。這些腫瘤包括多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌。其作用機(jī)制的研究大多集中于核因子κB(NF-κB)途徑。目前有文獻(xiàn)報(bào)道,硼替佐米還可以通過(guò)PI3

3、K/Akt途徑對(duì)多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌和胃癌等癌癥產(chǎn)生抗腫瘤作用。通過(guò)對(duì)PI3K/Akt途徑的調(diào)控,可以有效的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。目前在結(jié)腸癌中尚沒(méi)有硼替佐米通過(guò)對(duì)PI3K/Akt途徑的調(diào)控來(lái)影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的相關(guān)報(bào)道。
　　目的:1研究硼替佐米對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29惡性生物學(xué)行為的影響;
　　2.探討硼替佐米通過(guò)PTEN調(diào)控PI3K/Akt途徑及下游信號(hào)分子,影響結(jié)腸癌細(xì)胞

4、惡性生物學(xué)行為的機(jī)制。
　　方法:1.硼替佐米1-500nmol/L處理結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞24h及48h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率及藥物IC50值;2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)80nmol/L硼替佐米處理后HT-29細(xì)胞凋亡及周期的變化;3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察硼替佐米對(duì)HT-29細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響;4.激光共聚焦觀察E-cadherin在經(jīng)硼替佐米處理后HT-29的亞細(xì)胞定位;5.Westernblot技術(shù)

5、檢測(cè)caspase-3,E-cadherin,p-Akt和PTEN蛋白表達(dá)水平變化;6.設(shè)計(jì)下調(diào)PTENshRNA序列,包裝慢病毒載體,感染HT-29細(xì)胞系。建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并用硼替佐米處理后,觀察PTEN下調(diào)后,藥物對(duì)細(xì)胞凋亡、侵襲及遷移能力的影響。
　　結(jié)果:1.硼替佐米以時(shí)間依賴方式抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖能力,48小時(shí)IC50值是82.43nmol/L;2.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示藥物作用24小時(shí)后細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡,48小時(shí)

6、凋亡明顯。硼替佐米作用24小時(shí)后細(xì)胞周期明顯阻滯在G0/G1期;3.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示硼替佐米可以有效的降低HT-29細(xì)胞的侵襲及遷移能力;4.激光共聚焦試驗(yàn)顯示:硼替佐米處理HT-29細(xì)胞后,E-cadherin出現(xiàn)膜漿轉(zhuǎn)位現(xiàn)象;5.Westernblot實(shí)驗(yàn)顯示,80nmol/L硼替佐米處理結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞后PTEN蛋白、E-cadherin蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加,而p-Akt蛋白表達(dá)水平隨時(shí)

7、間的延長(zhǎng)明顯下降;6.慢病毒干擾抑制PTEN基因的表達(dá)后,用硼替佐米處理HT-29細(xì)胞,比較HT-29細(xì)胞與未加藥物的HT-29細(xì)胞的凋亡、侵襲及遷移能力,結(jié)果顯示無(wú)明顯差異,但下調(diào)PTEN基因后HT-29細(xì)胞的侵襲及遷移能力與正常HT-29細(xì)胞相比明顯增強(qiáng)。Westernblot實(shí)驗(yàn)顯示,硼替佐米處理結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞后PTEN、p-Akt蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:硼替佐米可以抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周