MSCs與去分化MSCs在成骨分化過程中免疫原性上調(diào)的研究.pdf

1、目的：
　　比較間充質干細胞（mesenchymal stemcells,MSCs）與去分化間充質干細胞（De-differentiated mesenchymal stem cells,De-MSCs）的成骨分化潛能，并探究MSCs與De-MSCs在成骨分化過程中免疫原性的改變及其分子機制。
　　方法：
　　用酶消化法從人胎盤中分離得到MSCs，經(jīng)鑒定后，采用更換培養(yǎng)基的方法誘導得到De-MSCs，并對De-MSCs

2、鑒定后用于實驗。
　?。?）比較MSCs與De-MSCs的成骨分化潛能，用CCK8法檢測MSCs與De-MSCs成骨誘導7d過程中的增殖效率；MSCs與De-MSCs進行成骨誘導7d后分別得到Ob-MSCs和Re-MSCs，實時熒光定量PCR（q-PCR，SYBR Green法）檢測成骨相關基因的表達；ALP染色比較MSCs與De-MSCs成骨分化的效率。
　?。?）采用流式細胞術（FCM）檢測MSCs，Ob-MSCs，De

3、-MSCs和Re-MSCs表面協(xié)同刺激分子的表達情況；并將4種細胞與T細胞進行共培養(yǎng)，CCK8法檢測 T細胞的增殖，檢測MSCs與De-MSCs在體外成骨分化過程中免疫原性的改變。
　　（3）將絲裂霉素C處理的MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs通過皮下植入免疫BALB/c小鼠，免疫5d后，眼眶靜脈取外周血，采用FCM檢測外周血單核細胞（PBMCs）中免疫細胞群的活化情況；免疫7d后，采用FCM檢測小鼠脾臟細胞

4、中免疫細胞群的活化情況，檢測MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs對小鼠的致敏情況。
　　（4）實時定量PCR（q-PCR，Taqman探針法）檢測MSCs，Ob-MSCs，De-MSCs和Re-MSCs中與免疫（miR-125b和miR-296）和成骨（miR-20a和miR-29b）相關的micro RNA（miRNA）的表達情況。
　　結果：
　?。?）De-MSCs與MSCs具有相似的細胞形態(tài)

5、、干細胞標志與多向分化潛能。CCK8法檢測細胞增殖顯示出在成骨誘導7d的過程中，De-MSCs較MSCs有更高的增殖效率。q-PCR結果顯示Re-MSCs中成骨相關基因BMP2，COL1和Runx2的表達較Ob-MSCs明顯增高。ALP染色顯示De-MSCs較MSCs具有更強的成骨能力。
　?。?）流式結果顯示，MSCs與De-MSCs體外成骨分化的過程中，正性共刺激分子的表達明顯增高，負性共刺激分子的表達明顯下降，且這種現(xiàn)象在D

6、e-MSCs中表現(xiàn)的更加明顯?；旌狭馨图毎磻∕LR）顯示，MSCs與De-MSCs可以抑制T細胞的增殖，但成骨分化后抑制T細胞增殖的程度降低，且Re-MSCs組T細胞的增殖效率高于Ob-MSCs組。
　?。?）PBMCs的流式結果顯示，分化的Ob-MSCs和Re-MSCs致敏小鼠后，PBMCs中的T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞的活化效果均要高于相應的未分化的MSCs和De-MSCs致敏的小鼠。同時，Re-MSCs致敏的效

7、果高于Ob-MSCs組。以上現(xiàn)象在脾臟細胞的流式結果中體現(xiàn)的更加明顯。
　?。?）miR-20a和miR-29b與成骨有關，而miR-125b與miR-296與免疫調(diào)節(jié)有關。q-PCR結果顯示，miR-20a和miR-125b在MSCs與De-MSCs成骨分化的過程中表達下調(diào)，而miR-29b和 miR-296在成骨分化的過程中表達上調(diào)，且miRNAs在De-MSCs分化過程中表達下調(diào)與上調(diào)的幅度均明顯高于MSCs。
　　結