瘦素參與呼吸神經(jīng)調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、呼吸化學(xué)感受器反射是一種重要的呼吸穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制，是機(jī)體與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換的主要方式，是維持正常新陳代謝和酸堿平衡的重要保證。呼吸化學(xué)感受性反射的反射弧由感受器、傳入神經(jīng)、呼吸中樞、傳出神經(jīng)和效應(yīng)器組成。呼吸化學(xué)感受器又分為外周化學(xué)感受器和中樞化學(xué)感受器。外周化學(xué)感受器主要位于頸動(dòng)脈體和主動(dòng)脈體，又以頸動(dòng)脈體為主，監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血中PaCO2、PaO2和[H+]的增加；其傳入神經(jīng)為竇神經(jīng)。中樞化學(xué)感受器主要位于低位腦干，包括孤束核（NTS）

2、，斜方體后核（RTN），迷走神經(jīng)背核，延髓腹外側(cè)頭端區(qū)，中縫核和藍(lán)斑核等，與呼吸中樞之間通過(guò)突觸聯(lián)系在一起。呼吸的節(jié)律中樞主要位于延髓腹側(cè)，最終通過(guò)傳出神經(jīng)支配到效應(yīng)器—呼吸肌上。當(dāng)機(jī)體吸入過(guò)多CO2時(shí)主要興奮中樞化學(xué)感受器反射，反射性的使呼吸加深加快，排除過(guò)多的CO2，維持機(jī)體酸堿平衡。當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí)，主要興奮外周化學(xué)感受器反射，反射性的使呼吸加深加快，以達(dá)到吸入更多O2，維持機(jī)體正常供氧的作用。一旦呼吸化學(xué)感受性反射的感受器和/或呼吸

3、中樞等部位發(fā)生結(jié)構(gòu)或功能性改變，呼吸化學(xué)感受器反射不能正常進(jìn)行，產(chǎn)生呼吸障礙疾病，如低通氣綜合征等。影響呼吸化學(xué)感受器反射的因素有很多，肥胖就是其中重要原因之一。肥胖造成的呼吸負(fù)荷過(guò)重和中樞驅(qū)動(dòng)力的下降都是產(chǎn)生肥胖低通氣的主要因素。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)由脂肪因子分泌的、在調(diào)節(jié)脂代謝平衡的關(guān)鍵因子—瘦素（Leptin），可能也參與了呼吸的調(diào)控作用，但其機(jī)制和作用靶點(diǎn)尚不明確。已有文獻(xiàn)證實(shí)頸動(dòng)脈體球細(xì)胞上主要分布有多種Leptin受體，

4、其中起主要作用的是Leptin受體b亞型，即ob-Rb。同樣在中樞化學(xué)感受器多部位上也發(fā)現(xiàn)有Leptin受體的廣泛分布。已有研究發(fā)現(xiàn)Leptin缺乏的ob/ob小鼠高碳酸性通氣反應(yīng)（Hypercapnic Ventilatory Response，HCVR）減弱，而外源性補(bǔ)充Leptin可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。但迄今為止，Leptin參與呼吸調(diào)控是否是通過(guò)其受體激活下游分子通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的還未見(jiàn)報(bào)道，且其作用部位和作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
　　

5、綜上所述，本研究旨在進(jìn)一步觀察Leptin系統(tǒng)是否參與呼吸化學(xué)感受器反射的調(diào)節(jié)，并驗(yàn)證此作用是否通過(guò)其受體及其下游通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，試圖明確其作用環(huán)節(jié)、位點(diǎn)和機(jī)制。本研究以臨床肥胖低通氣綜合癥（obesity hypoventination syndrome，OHS）作為呼吸障礙模型，利用ob-Rb受體缺陷Zucker肥胖大鼠作為L(zhǎng)eptin信號(hào)通路缺陷組，借助無(wú)創(chuàng)體積描記系統(tǒng)（小動(dòng)物肺功能測(cè)定）、分子生物學(xué)、免疫組織化學(xué)等技術(shù)，深入探討以

6、下幾點(diǎn)內(nèi)容：
　?。?）明確Leptin是否能易化中樞和外周呼吸化學(xué)感受性反射；
　?。?）上述作用是否為受體依賴的，是否通過(guò)其下游信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)；
　　（3）探討Leptin易化中樞呼吸化學(xué)感受性反射的作用靶點(diǎn)及其可能的機(jī)制；
　?。?）明確Leptin易化外周呼吸化學(xué)感受性反射的作用環(huán)節(jié)靶點(diǎn)和其可能的機(jī)制。
　　第一部分：Leptin易化中樞呼吸化學(xué)感受性反射的作用
　　目的：
　　通過(guò)激活

7、和抑制Leptin信號(hào)通路兩種手段，證實(shí)Leptin對(duì)中樞呼吸化學(xué)感受器反射的易化作用。
　　方法：
　　第一部分實(shí)驗(yàn)利用ob-Rb缺陷大鼠，觀察抑制Leptin信號(hào)通路對(duì)中樞呼吸化學(xué)感受器反射的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組：對(duì)照瘦Zucker大鼠組（Lean）和三組不同的肥胖低通氣模型組，即單純性肥胖低通氣模型組（Lean-HFD）；ob-Rb缺陷大鼠組（Obese）和ob-Rb缺陷大鼠合并過(guò)度肥胖組（Obese-HFD）。測(cè)定

8、大鼠血漿Leptin水平和孤束核ob-Rb下游通路中pSTAT3/STAT3蛋白表達(dá)，驗(yàn)證各組動(dòng)物L(fēng)eptin信號(hào)通路的功能狀態(tài)；利用WBP清醒呼吸記錄系統(tǒng)，描記清醒大鼠呼吸功能，階梯性的給各組動(dòng)物吸入含有2％，5%和8%CO2的混合氣體，記錄每分通氣量（MV）、潮氣量（TV）和呼吸頻率（BF）等呼吸參數(shù)的變化，以確定抑制Leptin信號(hào)通路對(duì)HCVR敏感性的影響。第二部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)皮下注射Leptin，觀察激活Leptin信號(hào)通路對(duì)HC

9、VR敏感性的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組：對(duì)照注射鹽水組（Lean+Saline）、對(duì)照注射Leptin組(Lean+Leptin)、ob-Rb缺陷注射鹽水組（Obese+Saline）和ob-Rb缺陷注射Leptin組（Obese+Leptin）。Lean+Leptin和Obese+Leptin組大鼠連續(xù)皮下注射Leptin(60μg/kg)7天，停藥恢復(fù)21天，共計(jì)觀察28天。Lean+Saline和Obese+Saline組注射相同劑量

10、的生理鹽水，作為空白對(duì)照。測(cè)定血漿Leptin水平和孤束核Leptin受體下游通路pSTAT3/STAT3蛋白表達(dá)，以確定激活Leptin信號(hào)通路的效果。利用WBP描記清醒呼吸功能，確定激活Leptin信號(hào)通路對(duì)HCVR反應(yīng)敏感性的影響。本部分使用的動(dòng)物均預(yù)先去除雙側(cè)竇神經(jīng)，已排除外周化學(xué)感受器的干擾。
　　結(jié)果：
　　1.Lean-HFD、Obese和 Obese-HFD組大鼠體重均高于Lean組（P<0.01），且伴有清

11、醒時(shí)高碳酸血癥（P<0.01）。Obese和Obese-HFD組大鼠血漿Leptin水平均高于Lean組，pSTAT3的蛋白表達(dá)均低于Lean組（P<0.01）。而Lean-HFD組大鼠的血漿Leptin水平和pSTAT3的蛋白表達(dá)與Lean組無(wú)差異。
　　2.基礎(chǔ)狀態(tài)下（100%O2），Lean-HFD、Obese和Obese-HFD組大鼠的MV、TV均低于Lean組，BF明顯高于Lean組（P<0.01）。結(jié)果表明，上述3組肥

12、胖動(dòng)物都存在低通氣現(xiàn)象。
　　3.階梯性吸入高濃度CO2后，4組大鼠的MV均隨CO2濃度的增加而增加。其中Lean-HFD組MV隨CO2濃度的增加，反應(yīng)性逐漸趨向于Lean組，在給予5%和8%CO2時(shí)，和Lean組已無(wú)差異。但Obese組和Obese-HFD組對(duì)CO2的反應(yīng)明顯低于Lean組（P<0.01），而Obese組和Obese-HFD組間無(wú)差異。
　　4.Lean+Leptin和Obese+Leptin組大鼠在注射L

13、eptin和消退過(guò)程中體重均逐漸增長(zhǎng)，與注射Saline組大鼠無(wú)明顯差異。在注射Leptin期間，Lean+Leptin和Obese+Leptin組大鼠血漿Leptin水平均升高4-8μg/L（P<0.05~0.01），停藥后逐漸消退。
　　5.在注射Leptin的第7天，Lean+Leptin組大鼠孤束核pSTAT3/STAT3表達(dá)明顯升高（P<0.01），而Obese+Leptin組大鼠相對(duì)于Obese+Saline組無(wú)明顯差

14、異。
　　6.在注射Leptin的第7天，Lean+Leptin和Obese+Leptin組大鼠動(dòng)脈血PaCO2和pH值與Lean+Saline和Obese+Saline組大鼠無(wú)顯著性差異。
　　7.在注射Leptin的第7天，清醒常氧平靜呼吸時(shí)， Lean+Leptin和Obese+Leptin組大鼠的MV、TV和BF值和Lean+Saline和Obese+Saline組相比無(wú)顯著性差異。同樣，各組大鼠注射前、注射第7天、

15、消退各時(shí)間點(diǎn)的基礎(chǔ)MV均無(wú)顯著性差異，結(jié)合上述注射Leptin后結(jié)果，說(shuō)明注射Leptin可以有效地激活Leptin信號(hào)通路，但并不影響動(dòng)物基礎(chǔ)體重、血?dú)夂秃粑?br>　　8.在注射Leptin的第7天、消退的第1周、第2周，階梯性升高CO2各組大鼠吸入氣體中的CO2，Lean+Leptin組大鼠的MV變化幅度明顯高于Lean+Saline組（P<0.01）。而Obese+Leptin組大鼠與Obese+Saline組的MV值無(wú)差異，

16、說(shuō)明注射Leptin可以易化HCVR。
　　小結(jié)：
　　ob-Rb缺陷可以降低動(dòng)物對(duì)CO2和/或高碳酸反應(yīng)的敏感性；激活Leptin信號(hào)通路可以增加對(duì)CO2和/或高碳酸反應(yīng)的敏感性，且能維持兩周。此作用可能通過(guò)Leptin受體信號(hào)通路及下游蛋白水平改變所實(shí)現(xiàn)。
　　第二部分：孤束核參與Leptin易化高碳酸性通氣反應(yīng)
　　目的：
　　通過(guò)激活和抑制Leptin信號(hào)通路兩種手段，探討NTS在Leptin易化呼

17、吸中的作用和可能機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分觀察ob-Rb缺陷對(duì)NTS酸敏感通道和受體的蛋白表達(dá)和CO2敏感性神經(jīng)元的數(shù)目的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組：對(duì)照瘦Zucker大鼠組（Lean）、單純性肥胖低通氣模型組（Lean-HFD）和ob-Rb缺陷大鼠組（Obese）。利用Western Blot方法檢測(cè)各組動(dòng)物基礎(chǔ)狀態(tài)下NTS組織中TASK通道、ASIC通道GPR4和Kir2.3蛋白水平。用免疫熒光的方法統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物經(jīng)8%

18、CO2處理后，NTS上CO2敏感性神經(jīng)元的數(shù)目。第二部分觀察激活Leptin信號(hào)通路對(duì)NTS酸敏感通道和受體的蛋白表達(dá)和CO2敏感性神經(jīng)元的數(shù)目的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組：Lean+Saline組、Lean+Leptin組、Obese+Saline組和Obese+Leptin組。利用Western Blot方法檢測(cè)各組動(dòng)物NTS上TASK通道、ASIC通道GPR4和Kir2.3蛋白水平。用免疫熒光的方法統(tǒng)計(jì)各組動(dòng)物經(jīng)8%CO2處理1小時(shí)后

19、，NTS的CO2敏感性神經(jīng)元的數(shù)目。
　　結(jié)果：
　　1.基礎(chǔ)狀態(tài)下，ob-Rb缺陷的Obese組大鼠NTS組織中的TASK-1，-2和-3通道蛋白，ASIC-1和-2通道，GPR4受體蛋白和Kir2.3通道蛋白表達(dá)明顯低于Lean組和Lean-HFD組（P<0.01），而Lean和Lean-HFD兩組間無(wú)差異。
　　2.激活Leptin信號(hào)通路后，Lean+Leptin組大鼠NTS組織中TASK-1，-2和-3通道蛋

20、白，ASIC-1和-2通道，GPR4受體蛋白和Kir2.3通道蛋白表達(dá)明顯高于Lean+saline組（P<0.01），而Obese+Saline組與Obese+Leptin組大鼠NTS組織中上述通道和受體蛋白水平無(wú)顯著性差異。
　　3.經(jīng)8%CO2處理1h復(fù)氧1h后，Obese組大鼠共表達(dá)ob-Rb和c-fos的神經(jīng)元總數(shù)目明顯低于Lean組和Lean-HFD組（P<0.01），而Lean組和Lean-HFD兩組間無(wú)差異。說(shuō)明O

21、bese組大鼠CO2敏感性神經(jīng)元數(shù)目與Lean組和Lean-HFD組相比較少。
　　4.經(jīng)8%CO2處理1h復(fù)氧1h后，Lean+Leptin組大鼠共表達(dá)ob-Rb和c-fos的神經(jīng)元總數(shù)目明顯高于Lean+saline組（P<0.01），而Obese+Saline組與Obese+Leptin組大鼠組間無(wú)差異。說(shuō)明激活Leptin信號(hào)通路可以增加CO2敏感性神經(jīng)元數(shù)目。
　　小結(jié)：
　　Leptin信號(hào)通路易化中樞化學(xué)

22、感受器反射的作用可能通過(guò)Leptin及其信號(hào)通路增加NTS神經(jīng)元敏感性和上調(diào)NTS組織中TASK通道、ASIC通道、GPR4受體和Kir2.3通道等酸敏感性通道表達(dá)所實(shí)現(xiàn)。
　　第三部分：Leptin易化外周呼吸化學(xué)感受性反射的作用和機(jī)制
　　目的：
　　通過(guò)激活和抑制Leptin信號(hào)通路兩種手段，探討頸動(dòng)脈體的Leptin信號(hào)通路對(duì)外周呼吸化學(xué)感受器反射的易化作用及其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　激活和抑

23、制Leptin信號(hào)通路的動(dòng)物分組同第二部分。本部分比較各組動(dòng)物雙側(cè)竇神經(jīng)完整和切除雙側(cè)竇神經(jīng)后，各組動(dòng)物對(duì)低氧（10%O2）反應(yīng)的差異，利用WBP記錄清醒低氧性通氣反應(yīng)（HVR）的呼吸功能；Western Blot法檢測(cè)各組動(dòng)物基礎(chǔ)狀態(tài)下頸動(dòng)脈體氧敏感性通道TASK-1，-2，-3和Kv1.5通道的蛋白表達(dá)，比較各組動(dòng)物基礎(chǔ)狀態(tài)和低氧狀態(tài)下頸動(dòng)脈體c-fos蛋白的表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.常氧狀態(tài)下，ob-Rb缺陷的

24、Obese組大鼠頸動(dòng)脈體ob-Rb受體蛋白和pSTAT3蛋白水平明顯低于Lean組和Lean-HFD組（P<0.01）。
　　2.暴露于10%O2時(shí)，3組大鼠的MV都相對(duì)常氧時(shí)增加。而ob-Rb缺陷大鼠在低氧時(shí)MV的變化值（△MV）明顯低于對(duì)照組和飲食誘導(dǎo)的單純肥胖大鼠（P<0.01）。切斷雙側(cè)竇神經(jīng)后，上述3組大鼠低氧時(shí)△MV均明顯減少，且組間無(wú)顯著性差異。
　　3.皮下注射Leptin60μg/kg7天后，Lean+Le

25、ptin組大鼠頸動(dòng)脈體的ob-Rb受體蛋白和pSTAT3蛋白水平明顯高于Lean組（P<0.01），而Obese+Saline組與Obese+Leptin組大鼠頸動(dòng)脈體的ob-Rb受體蛋白和pSTAT3蛋白組間無(wú)顯著性差異。
　　4.皮下注射Leptin第7天，Lean+Leptin組大鼠在低氧（10%）時(shí)的MV、TV和BF與Lean組相比明顯增加（P<0.05~0.01）。而Obese+Leptin與Obese+Saline組大

26、鼠的MV、TV和BF值無(wú)顯著差異。
　　5.皮下注射Leptin第7天，切除雙側(cè)竇神經(jīng)的各組動(dòng)物，對(duì)低氧（10%O2）的反應(yīng)明顯減弱，MV的變化都明顯減少，且3組無(wú)顯著差異。
　　6.皮下注射Leptin第14天，Lean+Leptin組大鼠在低氧時(shí)的MV與仍明顯高于Lean組（P<0.01）。而Obese+Leptin組大鼠的MV值與Obese+Saline組相比無(wú)顯著差異。
　　7.基礎(chǔ)狀態(tài)下，Obese組大鼠頸動(dòng)

27、脈體的TASK-1、TASK-2、TASK-3和Kv1.5的蛋白表達(dá)均低于Lean和Lean-HFD組（P<0.05~0.01），而Lean和Lean-HFD組間無(wú)顯著性差異。
　　8.皮下注射Leptin第7天，Lean+Leptin組大鼠頸動(dòng)脈體的TASK-1、TASK-2、TASK-3和Kv1.5的蛋白表達(dá)均高于Lean（P<0.01）。而Obese+Saline與Obese+Leptin組間無(wú)明顯差異。
　　9.在急

28、性低氧處理前，Lean、Lean-HFD和Obese組大鼠c-fos蛋白表達(dá)無(wú)差異，而在急性低氧處理后，雖3組動(dòng)物頸動(dòng)脈體的c-fos蛋白表達(dá)均有所升高，但Obese組大鼠明顯低于Lean和Lean-HFD組（P<0.01）。
　　10.皮下注射Leptin第7天，在急性低氧處理前，4組大鼠c-fos蛋白表達(dá)無(wú)差異，而在急性低氧處理后，4組動(dòng)物頸動(dòng)脈體的c-fos蛋白表達(dá)均有所升高，其中Lean+Leptin組大鼠明顯高于其他3組

29、（P<0.01）；而Obese+Saline與Obese+Leptin組間無(wú)明顯差異。
　　小結(jié)：
　　ob-Rb缺陷降低HVR的敏感性,而激活Leptin信號(hào)通路可以增加HVR的敏感性，且能維持一周。Leptin易化HVR的作用可能與其信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)TASK-1,-2,-3 and Kv1.5等氧敏感性通道有關(guān)。
　　第四部分：慢性間歇性低壓低氧易化中樞呼吸化學(xué)感受性反射
　　目的：
　　觀察慢性間歇性

30、低壓低氧對(duì)大鼠基礎(chǔ)呼吸和高碳酸性通氣反應(yīng)敏感性的影響，并探討其可能機(jī)制。
　　方法：
　　動(dòng)物分為四組，對(duì)照組（Control）、CIHH處理組（CIHH）、果糖誘導(dǎo)的肥胖組（HFD）和果糖誘導(dǎo)的肥胖大鼠經(jīng)CIHH處理組（CIHH-HFD）。利用WBP記錄清醒低氧性通氣反應(yīng)（HCVR）的呼吸功能；用生物化學(xué)或分子生物學(xué)的方法檢測(cè)血生化等指標(biāo)。
　　結(jié)果：
　　1.HFD組大鼠在清醒常氧狀態(tài)下，其每分通氣量（MV）

31、,潮氣量（TV），均明顯低于對(duì)照組，而經(jīng)低氧處理后，CIHH-HFD組大鼠的MV和TV與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。各組動(dòng)物的呼吸頻率（F）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.當(dāng)高氧高碳酸時(shí)，4組大鼠的MV隨CO2濃度的增加而增加，但HFD組大鼠對(duì)CO2的反應(yīng)明顯低于對(duì)照組，而經(jīng)CIHH處理后這一現(xiàn)象被改善。
　　3.四組大鼠的TV隨CO2濃度的增加而增加，但HFD組大鼠的TV隨CO2增加的幅度低于對(duì)照組（P<0.05~0.01,Fig.3B

32、），而經(jīng)CIHH處理后這一現(xiàn)象被改善。
　　4.四組大鼠的F隨CO2濃度的增加而增加，而HFD組大鼠的呼吸頻率在5%和8%CO2時(shí)明顯高于對(duì)照組，而經(jīng)CIHH處理后這一現(xiàn)象被改善。
　　小結(jié)：
　　CIHH可以改善果糖誘導(dǎo)的肥胖大鼠常氧狀態(tài)下的低通氣和對(duì)高碳酸性通氣反應(yīng)的敏感性，而這一作用可能是通過(guò)上調(diào)Leptin來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　Leptin信號(hào)通路可易化中樞和外周呼吸化學(xué)感受器反射。其易化中樞