瘦素調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細胞增殖及相關(guān)機制的研究.pdf

1、第一部分體外培養(yǎng)CD-1胎鼠神經(jīng)干細胞的鑒定及瘦素對神經(jīng)干細胞增殖的影響
　　目的：建立體外培養(yǎng) CD-1胎鼠神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法,并觀察瘦素對體外培養(yǎng)CD-1胎鼠神經(jīng)干細胞增殖的作用。方法：神經(jīng)干細胞來源自孕14天CD-1胎鼠海馬, DMEM/F12+2％B27添加物+1%N2添加物+20ng/mlEGF+20ng/ml bFGF,含青霉素200IU/L和鏈霉素100IU/L構(gòu)成神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基。用免疫細胞化學(xué)方法鑒定神經(jīng)上

2、皮巢蛋白( nestin)表達。利用5-溴-2’-脫氧尿苷(Bromodeoxyuridine5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)摻入DNA的特性,檢測神經(jīng)干細胞的增殖特性。采用配方為DMEM/F12+2%B27添加物+1%N2添加物+1%胎牛血清,含青霉素200IU/L和鏈霉素100IU/L的促分化培養(yǎng)基,誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化。檢測分化細胞的β-tublin或GFAP的免疫細胞化學(xué)染色情況,以了解分化特性。將第二

3、代神經(jīng)干細胞分散后種植于96孔板(n=8),按照如下分組:空白對照組即為0ng/ml組(細胞培養(yǎng)基中加入0ng/ml瘦素);瘦素處理組Ⅰ(細胞培養(yǎng)基的瘦素終濃度為10ng/ml);瘦素處理組Ⅱ(細胞培養(yǎng)基的瘦素終濃度為20ng/ml);瘦素處理組Ⅲ(細胞培養(yǎng)基的瘦素終濃度為40ng/ml);瘦素處理組Ⅳ(細胞培養(yǎng)基的瘦素終濃度為80ng/ml);瘦素處理組Ⅴ(細胞培養(yǎng)基的瘦素終濃度為160ng/ml);48小時添加瘦素一次,共計添加瘦素

4、3次,培養(yǎng)6天后,采用MTT法和CCK-8法觀察瘦素對神經(jīng)干細胞增殖的影響。結(jié)果：從孕14天CD-1胎鼠海馬獲得的細胞接種于神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基后,可以持續(xù)增殖并形成神經(jīng)球。傳代的細胞可表達Nestin蛋白,也可檢測到Brdu的摻入后表達。將神經(jīng)干細胞用促分化培養(yǎng)基培養(yǎng)后,神經(jīng)干細胞可被誘導(dǎo)分化,其產(chǎn)生的細胞可表達β-tublin或GFAP。MTT法和CCK-8法均提示,與對照組相比,10、20、40、80、160ng/ml的瘦素可表現(xiàn)

5、出較明顯的劑量依賴性促進神經(jīng)干細胞增殖效應(yīng),而且40ng/ml即具有理想增殖效果,80、160ng/ml的增值作用與之比較無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：本研究培養(yǎng)的細胞具有神經(jīng)干細胞的自我增值和分化潛能特性。瘦素可呈劑量依賴性促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞增殖,而且40ng/ml即具有理想增殖效果。
　　第二部分瘦素促進體外培養(yǎng)CD-1胎鼠神經(jīng)干細胞增殖作用中信號通路的研究
　　目的：探討JAK-STAT通路、cAMP/PKA/CREB通路

6、和Ras/Raf/MEK/ERK通路在瘦素促進體外培養(yǎng)CD-1胎鼠神經(jīng)干細胞增殖中的作用。方法：神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法同前述。1. JAK-STAT通路的阻斷劑AG490對瘦素促CD-1胎鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響:將第二代神經(jīng)干細胞分散后種植于PLL包被的96孔板,24小時后分組處理(每組8孔):對照組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基不添加任何藥物)、AG490溶劑對照組、AG490組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基中加入AG490,終濃度為10mM)、瘦素處

7、理組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基中加入瘦素,其終濃度為40ng/ml)、瘦素與AG490共同處理組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基中同時加入40ng/ml瘦素和10mM的AG490)。2. cAMP/PKA/CREB通路的阻斷劑H89對瘦素促CD-1胎鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響。分組同AG490組(每組8孔)。對照組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基不添加任何藥物)、H89溶劑對照組、H89組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基中加入H89,終濃度為10mM)、瘦素處理組(神經(jīng)干細

8、胞完全培養(yǎng)基中加入瘦素,其終濃度為40ng/ml)、瘦素與H89共同處理組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基中同時加入40ng/ml瘦素和10mM的H89)。3. Ras/Raf/MEK/ERK/CREB通路的阻斷劑PD98059對瘦素促CD-1胎鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響,分組同AG490組(每組8孔)。對照組(神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基不添加藥物)、PD98059溶劑對照組、PD98059組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基中加入PD98059,終濃度為10mM)、瘦素

9、處理組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基中加入瘦素,其終濃度為40ng/ml)、瘦素與PD98059共同處理組(神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基中同時加入40ng/ml瘦素和10mM的PD98059)。以上3個阻斷實驗中,48小時添加瘦素一次,共計添加瘦素3次,培養(yǎng)至第6天用CCK-8試劑盒檢測神經(jīng)干細胞的增殖情況。結(jié)果：CCK-8結(jié)果提示,與瘦素處理組相比,10mM的AG490處理體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞后,瘦素的促增殖能力明顯下降(P<0.001);10mM的

10、H89處理體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞后,瘦素的促增殖能力明顯下降(P<0.001);10mM的PD98059處理體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞后,瘦素的促增殖能力明顯下降(P<0.001)。結(jié)論：瘦素促體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的增殖作用與JAK-STAT通路、cAMP/PKA/CREB通路和Ras/Raf/MEK/ERK/CREB通路有關(guān),瘦素的促增殖作用可被3個通路的阻斷劑拮抗。
　　第三部分瘦素對皮質(zhì)酮抑制體外培養(yǎng)CD-1胎鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖的影

11、響及相關(guān)機制研究
　　目的：研究瘦素對皮質(zhì)酮抑制體外培養(yǎng) CD-1胎鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖的影響,以及NMDA受體在其中的作用。方法：1. CCK-8法觀察瘦素對皮質(zhì)酮抑制體外培養(yǎng)CD-1胎鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖的影響。將第二代神經(jīng)干細胞接種于96孔板(每組6孔),各組中DMSO終濃度均為0.1%。分組如下:對照組(Vehicle),神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中不添加任何藥物。皮質(zhì)酮組(cort),神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中添加皮質(zhì)酮,終濃度為10mM

12、。瘦素與皮質(zhì)酮合用組(leptin+cort),細胞培養(yǎng)基中同時加入瘦素和皮質(zhì)酮,終濃度分別為40ng/ml和10mM。MK-801阻斷組,神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中同時加入瘦素、皮質(zhì)酮、MK-801,前兩者終濃度分別為40ng/ml和10mM,MK-801參照文獻設(shè)定3個濃度(1、3、10mM)。培養(yǎng)至第72小時用CCK-8試劑盒檢測神經(jīng)干細胞的增殖情況。2. ELISA方法觀察瘦素及皮質(zhì)酮處理后24小時培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細胞膜NMDA2B受體表

13、達的影響。將第二代神經(jīng)干細胞接種于96孔板(每組6孔),各組中DMSO終濃度均為0.1%。分組如下:對照組(Vehicle),神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中不添加任何藥物。皮質(zhì)酮組(cort),神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中添加皮質(zhì)酮,終濃度為10mM。瘦素組(leptin),神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中添加瘦素,終濃度為40ng/ml。瘦素與皮質(zhì)酮合用組(leptin+cort),細胞培養(yǎng)基中同時加入瘦素和皮質(zhì)酮,終濃度分別為40ng/ml和10mM。24小時后,用E

14、LISA方法觀察神經(jīng)干細胞膜表面NMDA2B受體的表達改變。3. Western blot檢測瘦素及皮質(zhì)酮處理后24小時培養(yǎng)海馬神經(jīng)干細胞膜NMDA2B受體表達的影響。將第二代神經(jīng)干細胞接種于0.1%多聚賴氨酸包被的35mm培養(yǎng)皿中，每組3個培養(yǎng)皿,共4組,各組中DMSO終濃度均為0.1%,按照如下情況分組:對照組(Vehicle),神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中不添加任何藥物。皮質(zhì)酮組(cort),神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中添加皮質(zhì)酮,終濃度為10mM。

15、瘦素組(leptin),神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中添加瘦素,終濃度為40ng/ml。瘦素與皮質(zhì)酮合用組(leptin+cort),細胞培養(yǎng)基中同時加入瘦素和皮質(zhì)酮,終濃度分別為40ng/ml和10mM。培養(yǎng)至第24h后進行Western blot實驗。結(jié)果：1.10mM皮質(zhì)酮組吸光度值低于對照組(P<0.001)。與皮質(zhì)酮組相比,瘦素與皮質(zhì)酮合用組(leptin+cort)的吸光度值上升(P<0.001)。10mM皮質(zhì)酮、10mM的MK-801

16、與40ng/ml瘦素共同處理組的吸光度值顯著低于瘦素與皮質(zhì)酮合用組(P<0.01)。2.細胞ELISA檢測表明,與對照組相比,10mM皮質(zhì)酮可顯著抑制NMDA2B受體的表達(P<0.001),瘦素與皮質(zhì)酮共同處理后可逆轉(zhuǎn)這種結(jié)果。3. Western blot結(jié)果提示,與正常對照組相比,瘦素處理組可增加NMDAR2B受體表達約12.4%(P<0.01),而皮質(zhì)酮降低NMDAR2B受體表達約22.3%(P<0.01)。結(jié)論：40ng/ml