miRNA-134調(diào)控神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性參與抑郁癥發(fā)病的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景抑郁癥是一種由多種因素引起的、以持續(xù)性情緒低落和認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)、精神性疾病，嚴(yán)重影響人類健康。越來越多的研究表明抑郁癥患者特定腦區(qū)體積萎縮、結(jié)構(gòu)變化明顯、神經(jīng)細(xì)胞丟失，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA-134與大腦神經(jīng)元突觸的發(fā)育、成熟及可塑性調(diào)節(jié)密切相關(guān)，推測(cè)其可能在抑郁癥的腦功能失調(diào)中起重要作用。人參皂苷(ginsenoside Rg1，G-Rg1)具有神經(jīng)保護(hù)等多種作用，但其能否通過神經(jīng)保護(hù)作

2、用而改善抑郁癥狀的發(fā)生，目前尚不清楚。因此，本課題成功構(gòu)建慢性不可預(yù)知性溫和刺激(Chronic unpredictable mild stress，CUMS)導(dǎo)致的大鼠抑郁癥動(dòng)物模型，利用行為學(xué)、分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)等方法研究miRNA-134在神經(jīng)突觸可塑性調(diào)節(jié)及抑郁癥發(fā)病中的作用，并對(duì)人參皂苷G-Rg1的抗抑郁效應(yīng)及其機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　研究目的1.構(gòu)建大鼠抑郁癥動(dòng)物模型，通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選成功模型。2.研究miRNA-13

3、4-Limk1-Cofilin信號(hào)通路在抑郁癥大鼠神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性調(diào)節(jié)中的作用。3.研究miRNA-134-Limk1-Coiilin信號(hào)通路在抑郁癥發(fā)病中的作用。4.研究人參皂苷G-Rg1是否通過調(diào)控miRNA-134-Limk1-Cofilin信號(hào)通路而發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。
　　研究方法一、將160g-180gWistar雄性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、CUMS組、人參皂苷預(yù)處理組(G-Rg1+CUMS)和溶劑對(duì)照組(Nacl0.9％+

4、CUMS)。除空白對(duì)照組外，其余三組均給予為期6周的慢性不可預(yù)知性溫和刺激。人參皂苷預(yù)處理組和溶劑對(duì)照組在每次刺激前30分鐘以腹腔注射的方式分別給予G-Rg1（40mg/Kg）和0.9％的生理鹽水。6周后對(duì)各組進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等相關(guān)行為學(xué)測(cè)試，對(duì)建模成功的大鼠麻醉、取前額葉皮質(zhì)部位，進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)。利用高爾基染色、透射電鏡技術(shù)觀察前額葉皮質(zhì)腦區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化;利用Western Blot、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Lim

5、k1、p-Limk1、Cofilin、p-Cofilin、Spinophilin及BDNF等蛋白的表達(dá)變化，并用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平的變化;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)技術(shù)檢測(cè)miRNA-134的表達(dá)情況。二、在正常大鼠前額葉皮質(zhì)注射腺相關(guān)病毒包裝的HBA AV2/8-U6-miR134-CAG-GFP過表達(dá)miRNA-134，同時(shí)在抑郁癥大鼠前額葉皮質(zhì)注射

6、HBAAV2/8-U6-miR134-sponge-CAG-GFP抑制miRNA-134的表達(dá)，檢測(cè)對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性變化、一系列相關(guān)蛋白以及動(dòng)物抑郁行為的影響。
　　研究結(jié)果1.體重稱重實(shí)驗(yàn)中CUMS組大鼠體重增加量明顯減少(p＜0.05);糖水偏好實(shí)驗(yàn)中，CUMS組大鼠糖水?dāng)z入量明顯降低(p＜0.05);強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中CUMS組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間明顯增長(p＜0.05)。2.高爾基染色結(jié)果顯示，CUMS組大鼠較正常組前額葉皮質(zhì)樹

7、突棘密度明顯降低;透射電鏡結(jié)果顯示神經(jīng)元突觸數(shù)目減少，前后膜活性區(qū)變薄。3.Western Blot、PCR和免疫熒光結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，CUMS組大鼠前額葉皮質(zhì)部位Limk1、p-Limk1、Cofilin、p-Cofilin及Spinophilin蛋白表達(dá)降低。4.qPCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，CUMS組大鼠前額葉皮質(zhì)中miRNA-134表達(dá)量明顯上升。5.在病毒注射實(shí)驗(yàn)中，HBAAV2/8-U6-miR134-CAG

8、-GFP組大鼠miRNA-134表達(dá)較正常組大鼠增高，同時(shí)伴隨Limk1及Cofilin蛋白表達(dá)減少、磷酸化水平降低，樹突棘和突觸數(shù)目減少等神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性變化;而HBAAV2/8-U6-miR134-sponge-CAG-GFP組大鼠miRNA-134表達(dá)較抑郁組大鼠降低，同時(shí)伴隨Limk1及Cofilin蛋白表達(dá)增加、磷酸化水平增高，樹突棘和突觸數(shù)目增加等神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性變化。6.與CUMS組相比，人參皂苷預(yù)處理組大鼠miRNA-134

9、表達(dá)降低，Limk1、p-Limk1、Cofilin、p-Cofilin及BDNF蛋白表達(dá)增加，同時(shí)樹突棘密度增加，突觸數(shù)目增多，動(dòng)物抑郁樣行為顯著改善。
　　結(jié)論1.CUMS能有效誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為的產(chǎn)生，并伴隨前額葉皮質(zhì)部位發(fā)生神經(jīng)結(jié)構(gòu)可塑性變化。2.CUMS導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)miRNA-134表達(dá)量升高，進(jìn)而使Limk1、Cofilin及Spinophilin等蛋白表達(dá)量發(fā)生改變。3.人參皂苷G-Rg1可能通過調(diào)控miRNA-13