人參皂苷Rg1對阿爾茲海默病大鼠認知功能障礙的作用及機制研究.pdf

1、阿爾茲海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一種嚴重的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現為進行性的認知功能減退，預后不良，患者一般死于肺栓塞和繼發(fā)感染。阿爾茲海默病常散發(fā)，其臨床發(fā)病率女性是男性的1.5～3倍。神經病理學特征主要包括β樣淀粉樣蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)沉積形成的細胞外老年斑(senileplaque，SP)、tau蛋白的過度磷酸化形成的神經細胞內神經原纖維纏結以及神經元的丟失伴隨著膠

2、質細胞的增生等。其中不溶性淀粉樣蛋白雜亂無序的聚集被認為是AD發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。淀粉樣蛋白由淀粉樣前體蛋白（amyloidprecusorprotein，APP）水解產生:正常情況下，淀粉樣前體蛋白主要被α-水解酶水解生成s-APPα和C-端片段C83，這兩種水解產物均可通過正常途徑代謝;而在AD大腦中，淀粉樣前體蛋白則主要由β-水解酶水解生成β-APP多肽和C-端片段C99，隨后產物被γ-分泌酶水解生成一些長度為36-43個氨基酸的

3、不溶性片段，即Aβ。Aβ-42是淀粉樣蛋白最常見的形式之一，也是形成不溶性淀粉樣蛋白聚集的主要分型之一，與AD疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。人腦中α-分泌酶的主要類型是解整合素樣金屬蛋白酶(α-secretaseadisintegrinandmetallopeptidasedomain10，ADAM10)和ADAM17，而分布于神經元中的主要是ADAM10;β-分泌酶的主要類型是β位淀粉樣前體蛋白裂解酶-1(β-site-APPcleavag

4、eenzyme-1，BACE-1)，另一種類型BACE-2在神經系統(tǒng)中分布較少。研究發(fā)現，AD患者大腦中α-分泌酶較正常大腦分泌減少，而β-分泌酶則分泌增多或者活性增強，這一改變影響淀粉樣前體蛋白的水解過程，引起AD患者Aβ異常增多。
　　 雌激素與女性AD密切相關。研究發(fā)現女性絕經后記憶障礙的出現較較絕經前明顯增多，另外的研究也證實女性絕經后雌激素水平的降低是AD發(fā)病的高風險因素之一。研究發(fā)現，絕經后的婦女使用激素替代療法(e

5、strogenreplacementtherapy，ERT)能夠明顯推遲甚至阻止AD的發(fā)生。雌激素影響AD發(fā)生發(fā)展的確切機制尚不明確，但研究發(fā)現雌激素能夠通過調節(jié)體外培養(yǎng)的神經元和膠質細胞的淀粉樣前體蛋白水解過程來減少Aβ的產生，并且，雌激素已被證實在缺血休克和包括AD在內的許多神經退行性疾病中發(fā)揮著神經保護作用，提示雌激素可能通過影響淀粉樣前體蛋白水解過程及其神經保護作用發(fā)揮抗AD的作用。然而，臨床研究發(fā)現，雌激素替代療法有著不可忽視

6、的副作用。比如有研究發(fā)現使用雌激素替代療法的女性患者患子宮內膜癌和乳腺癌的風險明顯增加。因此，亟需尋找一種有效且安全的替代療法，而人參皂苷Rg1有可能符合這一要求而替代雌激素。
　　 人參皂苷Rg1是從中藥人參中提取的中藥有效單體之一，其分子式為C42H72O14，分子量為801.01，具有水溶性，且易溶于甲醇、乙醇。依據大樣本的臨床研究，人參皂苷Rg1是安全的植物雌激素，并不能帶來當前藥用雌激素所引起的生殖系統(tǒng)癌癥高發(fā)病率的風

7、險。有研究發(fā)現，人參皂苷Rg1與雌激素在諸如抗氧化、抑制凋亡等方面具有類似的功效，并且兩者的上述作用均是是通過胰島素樣生長因子受體（insulin-likegrowthfactorreceptor，IGF-IR）Ⅰ途徑和雌激素受體(estrogenreceptor，ER)途徑實現的。此外，人參皂苷Rg1還可能影響Aβ的生成與代謝過程。由此可見，人參皂苷Rg1可能作為雌激素的替代療法。
　　 本研究中，我們首先探討了利用去卵巢結合

8、D-半乳糖腹腔注射建立大鼠AD模型的可行性，發(fā)現去卵巢結合D-半乳糖腹腔注射處理的大鼠行為學改變以及海馬病理學改變均符合AD疾病情況下的變化，提示造模成功。然后，我們研究了人參皂苷Rg1對AD大鼠模型學習和記憶的影響。機制方面，主要研究了AD模型大鼠海馬中ADAM10和BACE1的改變情況，以明確人參皂苷Rg1對淀粉樣蛋白水解過程的影響。同時，我們還研究了活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase3的變化情況，以明確人參皂苷Rg

9、1對AD模型大鼠神經元凋亡的影響。
　　 目的
　　 本實驗研究首先驗證利用去卵巢手術聯(lián)合D-半乳糖腹腔注射建立大鼠AD模型的可行性。然后，以雌激素為對照，觀察人參皂苷Rg1對AD大鼠模型記憶功能障礙的改善作用，并進一步探討其作用機制。
　　 方法
　　 1.研究對象及分組:將96只Wistar大鼠隨機分為兩組，一組72只行去卵巢手術，另一組24只行假手術，術后行抗炎處理。將假手術組大鼠隨機等分為兩組:一

10、組按1ml/kg/d在大鼠腹部皮下注射生理鹽水(CT)，另一組按100mg/kg/d腹腔注射D-半乳糖(D);去卵巢手術組大鼠隨機等分為六組:第一組按1ml/kg/d的劑量在去卵巢手術大鼠的腹部皮下注射生理鹽水(O)，第二組的去卵巢大鼠同時注射D-半乳糖(O+D)，第三組是腹腔注射D-半乳糖的去卵巢大鼠按100μg/kg/d的劑量在皮下注射雌激素(O+D+E)，第四組是腹腔注射D-半乳糖的去卵巢大鼠腹腔注射5mg/kg/d劑量的人參皂苷

11、Rg1，為人參皂苷低劑量處理組(O+D+L)，第五組是腹腔注射D-半乳糖的去卵巢大鼠腹腔注射中劑量的，即10mg/kg/d的人參皂苷Rg1(O+D+M)，第六組是腹腔注射D-半乳糖的去卵巢大鼠用高劑量即腹腔注射20mg/kg/d的人參皂苷Rg1(O+D+H)。所有液體均按照每天需要注射的劑量稀釋，以使每天為大鼠注射的液體量保持在300μd左右，用藥6周。
　　 2.研究內容:(1)Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠的空間學習與記

12、憶的能力;(2)Elisa實驗檢測各組大鼠海馬組織中Aβ1-42的含量;(3)免疫組織化學法檢測各組大鼠海馬細胞中ADAM10和BACE1的表達情況;(4)實時定量PCR檢測大鼠海馬中ADAM10、BACE1、caspase3mRNA的表達情況;(5)Westernblot檢測大鼠海馬中ADAM10、活化的caspase3蛋白的表達情況。
　　 結果
　　 1.去卵巢結合D-半乳糖腹腔注射能夠顯著損害大鼠的認知功能，引起

13、大鼠海馬內Aβ1-42的高表達。
　　 (1)造模后各組大鼠Morris水迷宮的實驗結果:通過水迷宮實驗，我們發(fā)現去卵巢術、D-半乳糖的腹腔注射都能夠明顯延長大鼠尋找平臺的潛伏期時間（P＜0.05），而去卵巢術結合D-半乳糖腹腔注射組大鼠的潛伏期時間最長，較前兩者的差異有顯著性（P＜0.05）。而且，卵巢切除術、D-半乳糖的腹腔注射都能夠明顯降低大鼠第七天穿越平臺的次數，而卵巢切除術結合D-半乳糖腹腔注射組大鼠的第七天平均穿越平

14、臺的次數最少，其中，兩者結合組的平均穿越平臺數是對照組的40％，約是卵巢切除術后組、D-半乳糖腹腔注射組的70％。
　　 (2)造模后各組大鼠海馬中Aβ1-42的濃度測定:Elisa的實驗結果顯示去卵巢術結合D-半乳糖的腹腔注射能夠顯著提高大鼠海馬中Aβ1-42的水平(P＜0.05)，較對照組提高了約110％，而卵巢切除術、D-半乳糖的腹腔注射則具有相對較弱的作用。
　　 2.人參皂苷Rg1和雌激素能夠顯著改善模型大鼠的

15、學習和記憶能力
　　 (1)各組大鼠Morris水迷宮的實驗結果:使用人參皂苷Rg1和雌激素處理的各組大鼠，都明顯減少了造模所引起的潛伏期延長（P＜0.05）。三種不同劑量人參皂苷的處理組中，中劑量和高劑量人參皂苷Rg1處理組的大鼠在縮短平均潛伏期方面明顯優(yōu)于低劑量組（P＜0.05）。同時，各組大鼠的游泳速度沒有顯著變化，證明了各種處理因素沒有明顯影響大鼠的運動能力。并且，使用人參皂苷Rg1和雌激素治療的大鼠都能有效防止造模所引

16、起的大鼠穿越平臺次數的減少，治療后的大鼠穿越平臺數目明顯增多(P＜0.05)。而且與學習階段所得到的結果一致，中劑量和高劑量的人參皂苷Rg1處理組的大鼠穿越平臺的次數明顯多于低劑量組(P＜0.05)。
　　 (2)各組大鼠海馬中Aβ1-42的濃度測定:人參皂苷Rg1和雌激素的處理，都能夠不同程度地降低大鼠海馬中Aβ1-42的含量(P＜0.05)，其中，模型組大鼠海馬中Aβ1-42的含量是正常大鼠的2.2倍，中劑量的人參皂苷Rg1

17、降低到模型大鼠海馬中Aβ1-42含量的63％，高劑量處理組則降低到約69％，而低劑量只降低到造模組含量的85％，這說明中劑量和高劑量的治療效果明顯優(yōu)于低劑量組。
　　 3.人參皂苷Rg1和雌激素促進模型大鼠學習和記憶能力的機制研究
　　 (1)各組大鼠海馬中ADAM10和BACE1的陽性細胞表達情況:免疫組化的結果顯示，在對照組大鼠的海馬中ADAM10的陽性細胞率為67.4％±1.78％，而造模大鼠(O+D)的海馬中AD

18、AM10陽性細胞率僅為12±1.53％（P＜0.01）。用人參皂苷和雌激素處理后，低劑量人參皂苷Rg1組海馬中陽性細胞率為29.9±1.52％，中劑量人參皂苷Rg1處理組的陽性細胞率為66.45％±1.55％，高劑量人參皂苷Rg1處理組的陽性細胞率為50.3％±4.67％，雌激素處理組的陽性細胞率為50.3±4.67％。關于BACE1，造模組中BACE1陽性神經元率為62.3％±1.55％，使用人參皂苷Rg1和雌激素處理后，中劑量人參皂

19、苷Rg1處理后BACE1陽性細胞率為19.34％±1.03％，高劑量的Rg1處理后為25.13％±1.13％，雌激素處理后陽性細胞率則降為25.89％±1.42％（P＜0.05）。
　　 (2)實時定量檢測大鼠海馬中ADAM10、BACE1和cawspase3的表達情況:結果顯示，ADAM10的表達在造模組中明顯減少（P＜0.05），人參皂苷Rg1和雌激素能夠明顯改變造模大鼠的這種ADAM10的減少情況（P＜0.05）。并且數據

20、顯示，中劑量的人參皂苷Rg1組的ADAM10mRNA水平是造模組的1.8倍，高劑量的人參皂苷Rg1組的是造模組的1.6倍，而低劑量組ADAM10的基因水平僅為造模組的1.1倍，這說明中高劑量的人參皂苷Rg1的治療效果明顯優(yōu)于低劑量的人參皂苷。而關于BACE1的表達情況，去卵巢結合D-半乳糖能夠明顯促進大鼠海馬中BACE1的表達，人參皂苷Rg1和雌激素的處理都能夠明顯抑制造模引起的這種作用，且中劑量和高劑量組在降低BACE1的表達方面明顯

21、優(yōu)于低劑量組。
　　 (3)Westernblot實驗檢測ADAM10和caspase3的表達情況:蛋白印跡的實驗結果以及對其進行的光密度分析顯示ADAM10在海馬中的表達因造模急劇下降，且人參皂苷Rg1和雌激素的處理都能夠明顯升高因造模而降低的ADAM10的表達水平（P＜0.05）。而關于凋亡因子的表達情況，造模組大鼠海馬組織中活化的caspase3水平明顯升高(P＜0.05)，人參皂苷Rg1和雌激素的治療都能夠明顯降低活化的

22、casapse3的水平(P＜0.05)。其中，中劑量的人參皂苷Rg1處理的大鼠活化的casapse3水平是造模組的53％，高劑量處理組活化的casapse3的水平是造模組的51％，而低劑量的人參皂苷Rg1處理后活化的casapse3水平僅降為造模組的87％，說明中劑量和高劑量的人參皂苷Rg1在降低活化的caspase3的效果方面明顯優(yōu)于低劑量組。
　　 結論
　　 1.卵巢切除術結合D-半乳糖腹腔注射組大鼠在行為學改變和