自噬通過Stat3信號通路降低骨髓血細胞DNA的輻射損傷.pdf

1、目的：
　　研究細胞自噬對輻射所致DNA損傷的修復(fù)作用及其作用機制
　　方法：
　　1、采用流式細胞術(shù)和激光共聚焦熒光顯微鏡技術(shù)檢測小鼠全骨髓單個核細胞中帶熒光標(biāo)記γ-H2AX蛋白的表達情況。
　　2、采用堿性或中性的單細胞彗星電泳實驗檢測細胞中DNA雙鏈斷裂情況。
　　3、應(yīng)用免疫印跡方法檢測雷帕霉素（Rapamycin, Rap）處理后細胞中Stat3、自噬相關(guān)蛋白。
　　4、應(yīng)用熒光定量PCR檢

2、測慢病毒侵染后細胞中Stat3的mRNA水平。
　　5、應(yīng)用成像流式細胞術(shù)檢測處理后細胞的p-Stat3(Y705)在細胞核中的定位情況。
　　結(jié)果：
　　1、雷帕霉素對骨髓血細胞 DNA雙鏈的斷裂有輻射保護作用。無論在體內(nèi)還是體外，雷帕霉素處理組的骨髓單個核細胞輻照后產(chǎn)生的γ-H2AX都比單獨輻照組明顯降低。單細胞堿性彗星電泳實驗所檢測雷帕霉素處理組的細胞的彗星尾距也明顯地降低（為p<0.05），而能表征DNA雙鏈斷

3、裂（DSB）的中性彗星電泳實驗檢測發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理輻照組比單獨輻照組所產(chǎn)生的DSB減少（p<0.05）。
　　2、雷帕霉素通過激活自噬實現(xiàn) DNA雙鏈斷裂損傷的輻射保護作用。蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素預(yù)處理后單個核細胞的自噬水平升高。用 BafA1抑制自噬后，雷帕霉素介導(dǎo)的輻照保護作用明顯被抑制。運用造血系統(tǒng)特異性敲除Atg7的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在自噬缺失時，雷帕霉素介導(dǎo)的DSB損傷修復(fù)的作用受到抑制。
　　3、在對骨髓單

4、個核細胞的輻照保護作用中，Stat3的活性受到自噬調(diào)控。雷帕霉素預(yù)處理可以激活Stat3通路，抑制自噬或自噬缺陷都能明顯抑制Stat3的激活。
　　4、自噬對骨髓血細胞DNA的輻射保護作用依賴于Stat3。通過藥物抑制Stat3的活化或用shRNA干擾Stat3的表達，發(fā)現(xiàn)Stat3活性受到抑制時，自噬介導(dǎo)的輻照保護作用受到削弱。
　　結(jié)論：
　　雷帕霉素預(yù)處理能降低輻照導(dǎo)致的骨髓細胞DNA雙鏈斷裂的DNA損傷，這種作