白藜蘆醇通過STAT3-BMP信號通路調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞活化促進脊髓損傷修復(fù)的研究.pdf

1、目的:脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)，是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，還會引起一系列嚴重的并發(fā)癥，不僅會給患者造成身體的傷殘，甚至導(dǎo)致死亡。到目前為止，還尚未找到一種被大家所公認的有效的治療方法。大量資料顯示，藥物治療是目前被大家廣泛接受的治療手段，但是目前應(yīng)用于臨床的藥物大多副作用嚴重，因此尋求更為有效的治療藥物，是脊髓損傷研究的前沿課題。脊髓損傷后，活化的星形膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘢痕可改變受損部位的微環(huán)境，并分泌骨

2、形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic proteins2，BMP2)，抑制少突膠質(zhì)前體細胞分化為少突膠質(zhì)細胞，阻礙脊髓再生和修復(fù)。已有研究證實STAT3(SignalTransducer and Activators of Transcription3)通路激活是脊髓損傷后星形膠質(zhì)細胞活化的必要條件。而在星形膠質(zhì)細胞發(fā)育過程中，BMP2是STAT3通路的下游靶基因。據(jù)此我們推測，脊髓損傷后星形膠質(zhì)細胞中的STAT3被激活

3、導(dǎo)致BMP2分泌增加。因此，抑制STAT3的活性可抑制星形膠質(zhì)細胞的活化和增生，減少BMP2的分泌，進而促進少突膠質(zhì)前體細胞分化為少突膠質(zhì)細胞，最終有利于脊髓再生和功能的恢復(fù)。白藜蘆醇廣泛存在于天然植物中，具有多種有益的生物學(xué)活性，是STAT3的抑制劑。本文用白藜蘆醇，通過抑制STAT3/BMP通路的活性，觀察其對脊髓損傷修復(fù)的影響，為探討脊髓再生修復(fù)的機制和尋找治療脊髓損傷的新策略提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法:應(yīng)用脊髓損傷技術(shù)

4、建立大鼠脊髓損傷模型;原代培養(yǎng)并純化成年大鼠脊髓損傷的星形膠質(zhì)細胞，建立星形膠質(zhì)細胞活化的體外模型;用新生鼠的大腦純化培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，建立神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)體系。1）應(yīng)用細胞計數(shù)制作細胞生長曲線，結(jié)合免疫熒光染色、流式細胞術(shù)等，分析活化的星形膠質(zhì)細胞的特性;2）應(yīng)用MTT和流式細胞術(shù)等方法檢測白藜蘆醇對星形膠質(zhì)細胞增殖的影響;3）應(yīng)用Western-blot和免疫細胞化學(xué)等檢測白藜蘆醇對星形膠質(zhì)細胞中GFAP、STA

5、T3、P-STAT3、BMP2等蛋白表達的影響;4）應(yīng)用RT-qPCR檢測白藜蘆醇處理前后GFAP、STAT3、BMP2在轉(zhuǎn)錄水平的變化情況;5）免疫熒光染色檢測白藜蘆醇對神經(jīng)元軸突長度的影響;6）應(yīng)用高效液相色譜方法檢測腹腔注射白藜蘆醇后，正常鼠脊髓組織和損傷鼠脊髓組織吸收白藜蘆醇的情況;7）應(yīng)用BBB行為學(xué)檢測不同的打擊高度對鼠脊髓損傷程度的影響，以及評價白藜蘆醇對脊髓損傷的大鼠運動功能恢復(fù)的作用;8）采用HE染色和免疫熒光檢測白藜

6、蘆醇對脊髓損傷面積大小及組織中BMP2、STAT3、P-STAT3和NF-M等蛋白表達的影響。
　　結(jié)果:1）與來源于正常脊髓的星形膠質(zhì)細胞(NSCA)相比，源自損傷脊髓的星形膠質(zhì)細胞(ISCA)的增殖能力變強，膠原纖維酸性蛋白GFAP和骨形成素蛋白BMP2均表達上調(diào);2）白藜蘆醇處理后，ISCA的增殖活性降低，并發(fā)生周期阻滯;3) ISCA中與STAT3/BMP通路相關(guān)的GFAP、STAT3、BMP2等在基因和蛋白表達水平上均表

7、現(xiàn)為下調(diào);4）白藜蘆醇處理神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系后，神經(jīng)元軸突的長度明顯變長;5）腹腔注射白藜蘆醇后，在正常脊髓組織(NSC)和損傷脊髓組織(ISC)中均能檢測到白藜蘆醇;6）SCI-25mm組鼠的BBB行為學(xué)評分在術(shù)后7d即可達到20分左右，而SCI-50mm組鼠BBB行為學(xué)評分僅到11分左右;白藜蘆醇治療組的大鼠BBB行為學(xué)評分明顯高于DMSO對照組和假手術(shù)組;7）白藜蘆醇治療組中脊髓損傷區(qū)域的損傷面積較DMSO對照組變小，

8、治療組損傷區(qū)域的BMP2、STAT3和P-STAT3等蛋白的表達明顯下調(diào)，NF-M表達顯著增強。
　　結(jié)論:1）與SCI-25mm組比較，SCI-50mm組鼠脊髓損傷明顯，所以SCI-50mm是適合制作脊髓損傷模型的打擊高度;2）脊髓損傷后的星形膠質(zhì)細胞增殖活性變強，GFAP和BMP2表達上調(diào)，細胞處于活化狀態(tài)。表明ISCA是活化的星形膠質(zhì)細胞，從而成功的建立了活化的星形膠質(zhì)細胞體外模型;3）白藜蘆醇對活化的星形膠質(zhì)細胞具有抑制作