利拉魯肽通過AMPK信號通路促進自噬流減輕ZDF大鼠心肌損傷.pdf

1、研究背景:
　　糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的主要死亡原因之一，并呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。糖尿病性心肌病是糖尿病心血管并發(fā)癥中的重要一員，它指的是發(fā)生于糖尿病患者（包括1、2型），不可以用冠心病、高血壓性心肌病等其他原因解釋的心肌疾病。糖尿病性心肌病的診斷目前尚無一個統(tǒng)一的標準。其特點是心肌結(jié)構(gòu)和功能異常，例如左心室舒張和收縮功能障礙和心肌顯著的間質(zhì)纖維化。糖尿病性心肌病進一步進展可導(dǎo)致患者心力衰竭和心律失常等，重癥者甚至死亡。及時

2、有效地治療糖尿病性心肌病對降低糖尿病患者的死亡率有著積極的意義。然而，目前臨床上并沒有可以有效地治療糖尿病性心肌病的藥物。
　　利拉魯肽是一種人胰高血糖素樣肽-1類似物，現(xiàn)已在臨床上用于治療2型糖尿病。臨床與實驗研究表明，人胰高血糖素樣肽-1類似物具有心血管保護作用，例如改善冠狀動脈缺血患者的心肌功能以及減緩動脈粥樣硬化的病變。然而，利拉魯肽對糖尿病性心肌病是否同樣具有保護作用及其潛在的作用機制尚未闡明。
　　自噬是細胞內(nèi)的

3、一種用來維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的“自我消化”的途徑。自噬既可降解細胞內(nèi)錯誤折疊或變性的蛋白質(zhì)及其聚合物，也可降解受損的線粒體等細胞器。自噬被認為是一個動態(tài)的過程，被稱作為“自噬流”。有研究表明，自噬在糖尿病性心肌病的病變發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。利拉魯肽可促進肝細胞和胰島β細胞內(nèi)的自噬水平從而增加細胞活性，但是目前尚未證實利拉魯肽可通過促進心肌細胞內(nèi)的自噬流水平而產(chǎn)生心肌保護作用。另外，AMPK是一個經(jīng)典的自噬上游信號調(diào)節(jié)通路，AMPK信號通路受

4、到抑制可引起自噬水平的下降。有研究報道，利拉魯肽可激活骨骼肌細胞和肝細胞內(nèi)的AMPK信號通路。因此，提出假設(shè):利拉魯肽可通過激活A(yù)MPK信號通路促進心肌細胞自噬流從而減輕糖尿病性心肌損傷。
　　研究目的:
　　1.在肥胖Zucker大鼠糖尿病動物模型及原代心肌細胞高糖模型中，證實利拉魯肽可減輕糖尿病性心肌損傷。
　　2.探究利拉魯肽對糖尿病性心肌自噬的作用及其潛在的分子作用機制。
　　研究方法:
　　1.體

5、內(nèi)實驗
　　體內(nèi)實驗選用肥胖Zucker大鼠及其正常對照Zucker大鼠（8周齡）。肥胖Zucker大鼠給予高脂飲食，正常對照Zucker大鼠給予正常飲食。ZDF大鼠分組為:(1)正常對照組（Con組）;(2)糖尿病性心肌病組（DCM組）;(3)糖尿病性心肌病+利拉魯肽組（DCM+LG組）;(4)糖尿病性心肌病+氯喹組（DCM+CQ組）;(5)糖尿病性心肌病加+利拉魯肽+氯喹組（DCM+LG+CQ組）。皮下注射利拉魯肽(200μg

6、/kg)，腹腔注射氯喹(25mg/kg)，每天一次，連續(xù)注射8周。第16周，采集各組的大鼠血液樣本用于進一步檢測大鼠的血糖、血脂、心肌酶等生化指標。大鼠處死前一天，進行小動物超聲心功能檢測。將大鼠脫頸處死后，取材大鼠心肌組織進行固定，用于后續(xù)的電鏡、免疫組織化學(xué)、Masson三色染色、蛋白免疫印跡技術(shù)(WB)檢測。
　　2.體外實驗
　　采用SD大鼠新生乳鼠（1-3天）原代心肌細胞。將原代心肌細胞培養(yǎng)于一定濃度的含葡萄糖培養(yǎng)

7、液中，模擬體內(nèi)高糖狀態(tài)，建立原代心肌細胞高糖模型。細胞分組為:正常對照組（Con組）、高糖組(HG組)、高糖+利拉魯肽組(HG+LG組)、高糖+氯喹（HG+CQ組）、高糖+利拉魯肽+氯喹組（HG+LG+CQ組）、高糖+Comp C(HG+C)、高糖+利拉魯肽+Comp C(HG+LG+C)。心肌細胞在高糖環(huán)境中培養(yǎng)96小時，利拉魯肽和氯喹作用時間為24小時。每天更換細胞培養(yǎng)基。采用MTS檢測心肌細胞活力;采用TUNEL染色法檢測細胞凋亡

8、;采用Ad-mRFP-GFP-LC3病毒轉(zhuǎn)染檢測自噬流;采用WB檢測自噬相關(guān)蛋白(LC3、p62)和AMPK信號通路相關(guān)蛋白(AMPK、mTOR)。
　　研究結(jié)果:
　　1.利拉魯肽減輕心肌細胞損傷
　　(1)利拉魯肽降低ZDF大鼠血脂血糖水平。血生化檢測分析顯示:與DCM組相比，利拉魯肽處理組的血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHOL)水平是下降的。
　　(2)利拉魯肽減輕ZDF大鼠心肌損傷。ZDF大

9、鼠心臟超聲檢測結(jié)果顯示:與DCM組相比，利拉魯肽增加左室短軸縮短率(LVFS)值。血生化檢測分析顯示:在利拉魯肽組，大鼠血清肌酸激酶(CK)和血清乳酸脫氫酶(LDH)水平下降。應(yīng)用自噬抑制藥物氯喹后，大鼠血清CK和LDH水平增高。
　　(3)利拉魯肽減輕高糖誘導(dǎo)的原代心肌細胞損傷。MTS檢測結(jié)果顯示:利拉魯肽增加心肌細胞在高糖狀態(tài)下的細胞活性。TUNEL檢測顯示:利拉魯肽減少糖毒性引起的心肌細胞凋亡。在上述檢測方法中，利拉魯肽的保

10、護作用可被自噬抑制藥物氯喹大部分抑制。
　　2.利拉魯肽減輕ZDF大鼠心肌纖維化。Masson三色染色法顯示:利拉魯肽組心肌的膠原容積分數(shù)(CVF)小于DCM組。共同使用自噬抑制藥物氯喹后，CVF值再次增大。
　　3.利拉魯肽增加心肌細胞內(nèi)自噬水平。
　　(1)在體內(nèi)實驗中，利拉魯肽增加ZDF大鼠心肌組織的自噬表達水平。透射電鏡檢測顯示:利拉魯肽組的自噬小體的數(shù)量多于DCM組。免疫組織化學(xué)檢測顯示:利拉魯肽組中LC3B

11、蛋白的表達水平增加。WB檢測顯示:利拉魯肽組中LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加，p62蛋白表達下降。在上述檢測方法中，自噬抑制藥物氯喹可部分消除利拉魯肽對自噬的影響作用。
　　(2)在體外實驗中，利拉魯肽增加高糖培養(yǎng)的原代心肌細胞內(nèi)自噬水平。Ad-mRFP-GFP-LC3病毒轉(zhuǎn)染檢測顯示:利拉魯肽組的黃點（自噬體）和紅點數(shù)量（自噬溶酶體）均增加，尤其是黃點（自噬體）增加明顯。加入自噬體抑制劑3-MA后，黃點（自噬體）和紅點（自噬溶酶體）均明顯

12、減少。WB檢測顯示:利拉魯肽可增加LC3Ⅱ/Ⅰ比值。與HG+CQ組相比，HG+LG+CQ組的LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加。
　　4.利拉魯肽激活原代心肌細胞內(nèi)的AMPK-mTOR信號通路。WB檢測顯示:在利拉魯肽組中，p-AMPK/AMPK比值增大（AMPK磷酸化水平增高）和p-mTOR/mTOR比值減小(mTOR磷酸化水平下降)。
　　研究結(jié)論:
　　1.利拉魯肽通過增加心肌細胞內(nèi)的自噬水平減輕糖尿病性心肌損傷。