STAT3信號轉導通路在大鼠脊髓損傷后中樞痛形成中的作用.pdf

1、脊髓損傷后中樞神經病理性疼痛(CNP)是發(fā)生于脊髓損傷平面以下、痛覺已經消失區(qū)域的疼痛，是脊髓損傷后的頑固并發(fā)癥，可自發(fā)地產生或者由皮膚刺激所引發(fā)，且疼痛持續(xù)存在并難以忍受，給患者帶來極大痛苦，使患者不能完成自我照顧活動、不能履行治療性康復鍛煉計劃，嚴重影響患者的生活質量。CNP的臨床治療非常棘手，傳統的藥物和手術治療往往無明顯效果，這是因為其發(fā)生機制目前仍不明確。脊髓損傷后CP的病理變化是非常復雜的過程，而有關脊髓損傷后中樞神經免疫機

2、制在CNP的發(fā)病中的作用則是目前疼痛學領域研究的熱點。Janus kinase(JAK)/signal transducer and activators of transcription(STAT)介導的信號途徑是一條重要的信號通道，可以發(fā)揮信號轉導和基因轉錄活化子蛋白的雙重作用，介導多種細胞因子和生長因子的細胞內信號轉導過程并活化相應靶基因，從而產生生物學效應。其中STAT3參與了許多細胞因子及生長因子介導的細胞增殖及分化過程;ST

3、AT3主要表達在CNS中小膠質細胞上，有研究證實外周神經損傷所致神經病理性疼痛的早期形成過程中脊髓背角的小膠質細胞上的STAT3是關鍵信號轉導分子。本研究擬采用基因干擾技術，抑制大鼠脊髓STAT3基因的表達，研究JAK/STAT3信號轉導通路在大鼠脊髓損傷后中樞神經病理性疼痛中的作用，為研發(fā)以JAK/STAT3信號轉導通路為靶點鎮(zhèn)痛新藥提供理論基礎。
　　第一部分脊髓損傷后中樞神經痛模型大鼠脊髓背角STAT3表達變化及意義

4、　　目的:觀察T10脊髓鈍性損傷后中樞神經痛模型大鼠后肢疼痛行為學改變，腰4～6節(jié)段脊髓背角STAT3信號通路的表達分布變化，以及脊髓背角膠質細胞的激活狀況。
　　方法:雌性SD大鼠42只，隨機分為CNP組、假手術組和正常對照組，CNP組建立大鼠T10節(jié)段脊髓鈍性損傷后中樞神經痛(CNP,below-level pain)模型，假手術組僅暴露T10節(jié)段脊髓不鈍性打擊，模型制作前一天及術后28天內每隔7天觀察各組大鼠后肢疼痛行為學變

5、化進行機械痛閾、熱縮足持續(xù)時間及后肢運動功能檢測，并于術后第3、7、14、21、28天處死取脊髓腰4～6節(jié)段，利用免疫組化、熒光雙標染色、western-blot及qRT-PCR方法STAT3與膠質細胞的激活和共表達情況，同時檢測脊髓背角STAT3mRNA和蛋白表達的變化，探討STAT3的表達上調與時間相關的大鼠痛閾程度改變之間是否相關。
　　結果:術前各組動物基礎痛閾值之間無統計學差異;CNP組與normal組和sham組相比，

6、術后第3天痛閾值即明顯下降，并于術后第14天降至最低點，持續(xù)至第28天仍下降明顯，差異有統計學意義，同時CNP組大鼠后肢運動BBB評分脊髓損傷后第一天為0，損傷后3天開始恢復，28天時恢復至損傷前80％;CNP組大鼠腰4～6節(jié)段脊髓背角處免疫組化顯示STAT3陽性細胞以灰質表達為主，并可見于灰質全層均有較多表達，尤其在脊髓背角高表達，與sham組相比，差異有統計學意義;熒光雙標染色提示CNP組脊髓背角淺層的STAT3陽性細胞主要為小膠質

7、細胞，共表達從術后第3天開始明顯增多，第14天表達最多，并持續(xù)至第28天與sham組相比，差異有統計學意義; Westemblot分析結果與免疫組織化學結果基本相一致，即在術后第7d、21d、28d，CNP組大鼠腰4～6節(jié)段脊髓背角中STAT3蛋白的表達水平與術前相比明顯增加，差異有統計學意義; STAT3的mRNA表達于術后14天明顯增高達最大值，并持續(xù)至第28天，于第28天仍明顯高于sham組，差異有統計學意義。相關性分析結果表明脊

8、髓背角STAT3表達水平與脊髓損傷中樞神經痛大鼠疼痛程度之間具有明顯的正相關。
　　結論:脊髓T10鈍性損傷后中樞神經痛大鼠腰段脊髓背角小膠質細胞激活，且小膠質細胞內STAT3蛋白表達明顯上調，并與大鼠的疼痛學行為變化相平行。
　　第二部分靶向STAT3小分子干擾RNA慢病毒載體的構建和鑒定
　　目的:以小分子干擾RNA技術構建大鼠STAT3siRNA慢病毒載體，并在大鼠小膠質細胞（HAPI細胞株）中行體外干擾效率鑒定

9、。
　　方法:分別設計STAT3-shRNA干擾序列及陰性對照序列，BLAST驗證基因同源性。設計的序列經體外退火形成雙鏈寡核苷酸，將其與以HpaI/Xhol酶切后的載體pGCL連接，轉化DH5a感受態(tài)細胞，抽提質粒后測序鑒定。以HpaI單酶切鑒定并克隆質粒，即為重組慢病毒載體。將慢病毒包裝系統三質粒和重組慢病毒載體混合，導入293T細胞，包裝成病毒后，采用系列梯度稀釋法，測定病毒滴度。同法構建陰性干擾慢病毒載體。將包裝好的病毒轉

10、染HAPI細胞，分為干擾組，陰性干擾組和空白對照組3組，干擾組和陰性干擾組分別加入構建的干擾載體和陰性干擾載體，空白對照組加入等量不含病毒的培養(yǎng)基。轉染96h后以westemBlot檢驗STAT3蛋白表達驗證慢病毒載體干擾效率。并分別取3實驗組HAPI細胞滴片，以STAT3多克隆抗體為一抗，FITC標一記的山羊抗兔IgG為二抗，間接免疫熒光法觀察STAT3表達情況。
　　結果:測序結果顯示，STAT3siRNA干擾序列成功插入pG

11、CL載體，該重組質粒與pHelper1.0載體重組、轉化、氨節(jié)青霉素抗性篩選陽性克隆，酶切驗證質粒重組成功。在293T細胞中進行病毒包裝，系列梯度稀釋法檢測病毒懸液的滴度，測定慢病毒滴度為2×108Tu/ml。Western Blot檢驗STAT3蛋白表達，干擾組明顯低于陰性干擾組和空白對照組，抑制效率為75％。免疫熒光顯示陰性干擾組和空白對照組的熒光則呈較強表達，而干擾組的綠色熒光表達則明顯減弱。
　　結論:成功構建小鼠STAT

12、3siRNA慢病毒載體LV-GFP-STAT3，可以有效體外抑制HAPI細胞內STAT3蛋白的表達。
　　第三部分鞘內注射STAT3siRNA可減輕大鼠脊髓損傷后中樞神經病理性疼痛
　　目的:觀察攜帶STAT3siRNA片段重組慢病毒對脊髓損傷后中樞神經痛大鼠鎮(zhèn)痛作用。
　　方法:選取36只成年雌性SD大鼠制作T10脊髓鈍性損傷中樞神經痛(CNP，below-level pain)模型，術后第1天經蛛網膜下腔內置管后將

13、模型大鼠隨機分為3組:生理鹽水組（鞘內注入10μ l生理鹽水）、S TAT3siRNA組（鞘內注入10μ l重組慢病毒載體）和陰性對照siRNA組（鞘內注入10μ慢病毒空載體），連續(xù)給藥3天。觀察各組脊髓損傷術后7d、14d、28d的疼痛行為學和后肢運動功能的改變。不同時間點取腰段脊髓進行熒光顯微鏡檢測GFP（綠色熒光蛋白）的表達，qRT-PCR檢測STAT3基因的mRNA含量、WestemBlot測定STAT3蛋白含量以觀察RNA干擾

14、效應，qRT-PCR-PCR檢測OX-42、AFT-3和 MCP-1表達水平的變化，及給藥后4周通過組織學觀察脊髓損傷神經修復情況。
　　結果:1.鞘內注射LV-GFP-STAT3重組慢病毒載體后，CNP大鼠機械痛敏和熱痛敏明顯得到改善，但不能完全阻止疼痛的發(fā)展;2.鞘內注射LV-GFP-STAT3重組慢病毒載體可顯著降低模型大鼠腰段脊髓的STAT3mRNA的表達和蛋白質水平，OX-42、AFT-3和MCP-1mRNA表達也顯著降

15、低;3.大鼠脊髓損傷后運動功能BBB評分，所有實驗大鼠在損傷后第1天都表現為喪失所有后肢運動，BBB評分均為0分，但損傷14天后STAT3siRNA組恢復情況明顯好于空慢病毒組及生理鹽水組，雖然至損傷后第28天各實驗組大鼠的神經功能均有一定程度的神經恢復，但STAT3siRNA組和生理鹽水組及空慢病毒組之間神經功能評分結果差異顯著，生理鹽水組和空慢病毒組之間神經功能評分結果無明顯差異。
　　結論:鞘內注射STAT3siRNA慢病毒