STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大鼠脊髓損傷后中樞痛形成中的作用.pdf

1、脊髓損傷后中樞神經(jīng)病理性疼痛(CNP)是發(fā)生于脊髓損傷平面以下、痛覺已經(jīng)消失區(qū)域的疼痛，是脊髓損傷后的頑固并發(fā)癥，可自發(fā)地產(chǎn)生或者由皮膚刺激所引發(fā)，且疼痛持續(xù)存在并難以忍受，給患者帶來極大痛苦，使患者不能完成自我照顧活動、不能履行治療性康復(fù)鍛煉計劃，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。CNP的臨床治療非常棘手，傳統(tǒng)的藥物和手術(shù)治療往往無明顯效果，這是因?yàn)槠浒l(fā)生機(jī)制目前仍不明確。脊髓損傷后CP的病理變化是非常復(fù)雜的過程，而有關(guān)脊髓損傷后中樞神經(jīng)免疫機(jī)

2、制在CNP的發(fā)病中的作用則是目前疼痛學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。Janus kinase(JAK)/signal transducer and activators of transcription(STAT)介導(dǎo)的信號途徑是一條重要的信號通道，可以發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白的雙重作用，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長因子的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程并活化相應(yīng)靶基因，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。其中STAT3參與了許多細(xì)胞因子及生長因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖及分化過程;ST

3、AT3主要表達(dá)在CNS中小膠質(zhì)細(xì)胞上，有研究證實(shí)外周神經(jīng)損傷所致神經(jīng)病理性疼痛的早期形成過程中脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞上的STAT3是關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。本研究擬采用基因干擾技術(shù)，抑制大鼠脊髓STAT3基因的表達(dá)，研究JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大鼠脊髓損傷后中樞神經(jīng)病理性疼痛中的作用，為研發(fā)以JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點(diǎn)鎮(zhèn)痛新藥提供理論基礎(chǔ)。
　　第一部分脊髓損傷后中樞神經(jīng)痛模型大鼠脊髓背角STAT3表達(dá)變化及意義

4、　　目的:觀察T10脊髓鈍性損傷后中樞神經(jīng)痛模型大鼠后肢疼痛行為學(xué)改變，腰4～6節(jié)段脊髓背角STAT3信號通路的表達(dá)分布變化，以及脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀況。
　　方法:雌性SD大鼠42只，隨機(jī)分為CNP組、假手術(shù)組和正常對照組，CNP組建立大鼠T10節(jié)段脊髓鈍性損傷后中樞神經(jīng)痛(CNP,below-level pain)模型，假手術(shù)組僅暴露T10節(jié)段脊髓不鈍性打擊，模型制作前一天及術(shù)后28天內(nèi)每隔7天觀察各組大鼠后肢疼痛行為學(xué)變

5、化進(jìn)行機(jī)械痛閾、熱縮足持續(xù)時間及后肢運(yùn)動功能檢測，并于術(shù)后第3、7、14、21、28天處死取脊髓腰4～6節(jié)段，利用免疫組化、熒光雙標(biāo)染色、western-blot及qRT-PCR方法STAT3與膠質(zhì)細(xì)胞的激活和共表達(dá)情況，同時檢測脊髓背角STAT3mRNA和蛋白表達(dá)的變化，探討STAT3的表達(dá)上調(diào)與時間相關(guān)的大鼠痛閾程度改變之間是否相關(guān)。
　　結(jié)果:術(shù)前各組動物基礎(chǔ)痛閾值之間無統(tǒng)計學(xué)差異;CNP組與normal組和sham組相比，

6、術(shù)后第3天痛閾值即明顯下降，并于術(shù)后第14天降至最低點(diǎn)，持續(xù)至第28天仍下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時CNP組大鼠后肢運(yùn)動BBB評分脊髓損傷后第一天為0，損傷后3天開始恢復(fù)，28天時恢復(fù)至損傷前80％;CNP組大鼠腰4～6節(jié)段脊髓背角處免疫組化顯示STAT3陽性細(xì)胞以灰質(zhì)表達(dá)為主，并可見于灰質(zhì)全層均有較多表達(dá)，尤其在脊髓背角高表達(dá)，與sham組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;熒光雙標(biāo)染色提示CNP組脊髓背角淺層的STAT3陽性細(xì)胞主要為小膠質(zhì)

7、細(xì)胞，共表達(dá)從術(shù)后第3天開始明顯增多，第14天表達(dá)最多，并持續(xù)至第28天與sham組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義; Westemblot分析結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果基本相一致，即在術(shù)后第7d、21d、28d，CNP組大鼠腰4～6節(jié)段脊髓背角中STAT3蛋白的表達(dá)水平與術(shù)前相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義; STAT3的mRNA表達(dá)于術(shù)后14天明顯增高達(dá)最大值，并持續(xù)至第28天，于第28天仍明顯高于sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析結(jié)果表明脊

8、髓背角STAT3表達(dá)水平與脊髓損傷中樞神經(jīng)痛大鼠疼痛程度之間具有明顯的正相關(guān)。
　　結(jié)論:脊髓T10鈍性損傷后中樞神經(jīng)痛大鼠腰段脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞激活，且小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)STAT3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并與大鼠的疼痛學(xué)行為變化相平行。
　　第二部分靶向STAT3小分子干擾RNA慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定
　　目的:以小分子干擾RNA技術(shù)構(gòu)建大鼠STAT3siRNA慢病毒載體，并在大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（HAPI細(xì)胞株）中行體外干擾效率鑒定

9、。
　　方法:分別設(shè)計STAT3-shRNA干擾序列及陰性對照序列，BLAST驗(yàn)證基因同源性。設(shè)計的序列經(jīng)體外退火形成雙鏈寡核苷酸，將其與以HpaI/Xhol酶切后的載體pGCL連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，抽提質(zhì)粒后測序鑒定。以HpaI單酶切鑒定并克隆質(zhì)粒，即為重組慢病毒載體。將慢病毒包裝系統(tǒng)三質(zhì)粒和重組慢病毒載體混合，導(dǎo)入293T細(xì)胞，包裝成病毒后，采用系列梯度稀釋法，測定病毒滴度。同法構(gòu)建陰性干擾慢病毒載體。將包裝好的病毒轉(zhuǎn)

10、染HAPI細(xì)胞，分為干擾組，陰性干擾組和空白對照組3組，干擾組和陰性干擾組分別加入構(gòu)建的干擾載體和陰性干擾載體，空白對照組加入等量不含病毒的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染96h后以westemBlot檢驗(yàn)STAT3蛋白表達(dá)驗(yàn)證慢病毒載體干擾效率。并分別取3實(shí)驗(yàn)組HAPI細(xì)胞滴片，以STAT3多克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)一記的山羊抗兔IgG為二抗，間接免疫熒光法觀察STAT3表達(dá)情況。
　　結(jié)果:測序結(jié)果顯示，STAT3siRNA干擾序列成功插入pG

11、CL載體，該重組質(zhì)粒與pHelper1.0載體重組、轉(zhuǎn)化、氨節(jié)青霉素抗性篩選陽性克隆，酶切驗(yàn)證質(zhì)粒重組成功。在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，系列梯度稀釋法檢測病毒懸液的滴度，測定慢病毒滴度為2×108Tu/ml。Western Blot檢驗(yàn)STAT3蛋白表達(dá)，干擾組明顯低于陰性干擾組和空白對照組，抑制效率為75％。免疫熒光顯示陰性干擾組和空白對照組的熒光則呈較強(qiáng)表達(dá)，而干擾組的綠色熒光表達(dá)則明顯減弱。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建小鼠STAT

12、3siRNA慢病毒載體LV-GFP-STAT3，可以有效體外抑制HAPI細(xì)胞內(nèi)STAT3蛋白的表達(dá)。
　　第三部分鞘內(nèi)注射STAT3siRNA可減輕大鼠脊髓損傷后中樞神經(jīng)病理性疼痛
　　目的:觀察攜帶STAT3siRNA片段重組慢病毒對脊髓損傷后中樞神經(jīng)痛大鼠鎮(zhèn)痛作用。
　　方法:選取36只成年雌性SD大鼠制作T10脊髓鈍性損傷中樞神經(jīng)痛(CNP，below-level pain)模型，術(shù)后第1天經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)置管后將

13、模型大鼠隨機(jī)分為3組:生理鹽水組（鞘內(nèi)注入10μ l生理鹽水）、S TAT3siRNA組（鞘內(nèi)注入10μ l重組慢病毒載體）和陰性對照siRNA組（鞘內(nèi)注入10μ慢病毒空載體），連續(xù)給藥3天。觀察各組脊髓損傷術(shù)后7d、14d、28d的疼痛行為學(xué)和后肢運(yùn)動功能的改變。不同時間點(diǎn)取腰段脊髓進(jìn)行熒光顯微鏡檢測GFP（綠色熒光蛋白）的表達(dá)，qRT-PCR檢測STAT3基因的mRNA含量、WestemBlot測定STAT3蛋白含量以觀察RNA干擾

14、效應(yīng)，qRT-PCR-PCR檢測OX-42、AFT-3和 MCP-1表達(dá)水平的變化，及給藥后4周通過組織學(xué)觀察脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)情況。
　　結(jié)果:1.鞘內(nèi)注射LV-GFP-STAT3重組慢病毒載體后，CNP大鼠機(jī)械痛敏和熱痛敏明顯得到改善，但不能完全阻止疼痛的發(fā)展;2.鞘內(nèi)注射LV-GFP-STAT3重組慢病毒載體可顯著降低模型大鼠腰段脊髓的STAT3mRNA的表達(dá)和蛋白質(zhì)水平，OX-42、AFT-3和MCP-1mRNA表達(dá)也顯著降

15、低;3.大鼠脊髓損傷后運(yùn)動功能BBB評分，所有實(shí)驗(yàn)大鼠在損傷后第1天都表現(xiàn)為喪失所有后肢運(yùn)動，BBB評分均為0分，但損傷14天后STAT3siRNA組恢復(fù)情況明顯好于空慢病毒組及生理鹽水組，雖然至損傷后第28天各實(shí)驗(yàn)組大鼠的神經(jīng)功能均有一定程度的神經(jīng)恢復(fù)，但STAT3siRNA組和生理鹽水組及空慢病毒組之間神經(jīng)功能評分結(jié)果差異顯著，生理鹽水組和空慢病毒組之間神經(jīng)功能評分結(jié)果無明顯差異。
　　結(jié)論:鞘內(nèi)注射STAT3siRNA慢病毒