基于線粒體DNA多態(tài)性鑒定海魚種類.pdf

1、在煙臺地區(qū)漁業(yè)生產(chǎn)中，海魚商品生產(chǎn)在當?shù)啬酥辽綎|省漁業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位。一些商家為了追求較高的商業(yè)利潤，在海魚產(chǎn)品捕撈、加工處理、市場流通等環(huán)節(jié)中，存在以次充好及魚種標簽混亂等問題。在生活實踐中，人們一般依據(jù)形態(tài)特征對魚種進行鑒別，但有些魚種之間的外形特征較為相似，難以區(qū)分。如果魚肉產(chǎn)品經(jīng)過加工、尤其是深加工后，其種類來源更難以確認。本研究旨在建立一種簡便準確的海魚種類鑒別方法，為魚肉制品的溯源和安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。
　　首先

2、，提取10種海魚的基因組DNA；然后，根據(jù)GenBank中發(fā)布的DNA序列，參照相關(guān)文獻，利用引物設(shè)計軟件設(shè)計控制合成線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）和亞基Ⅲ（COⅢ）基因的通用引物，對10種魚樣本進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)檢測純化后克隆、測序；第三，將測序結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中進行相似性檢索，并比較分析COⅠ和COⅢ序列，探討各種魚種間分子系統(tǒng)學關(guān)系，對COⅢ序列是否適宜作為分子標記、是否適宜作為海洋魚類DNA條形碼的潛在序列

3、進行了簡要評價；第四，依據(jù)測序結(jié)果，利用Primer5.0軟件對10種魚的COⅠ和COⅢ2個基因分別進行限制性內(nèi)切酶酶切分析，最終選用NlaⅢ和HinfⅠ2種內(nèi)切酶進行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得10種海魚的COⅠ、COⅢ2個基因的特異酶切片段圖譜；最后，依據(jù)測序結(jié)果，利用DNAMAN軟件對10種魚的COⅠ、COⅢ2個基因分別進行序列比對，在堿基序列差異較大的區(qū)域設(shè)計各魚種特異引物，進行物種特異性PCR擴增，并嘗試組合部分魚種特

4、異引物進行復(fù)合PCR擴增。
　　研究結(jié)果表明，設(shè)計的通用引物能有效地擴增出COⅠ和COⅢ兩個靶基因片段。尤其對各魚種COⅢ基因片段的擴增產(chǎn)物通過測序、比對分析，獲得了NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中迄今未見報道的高眼鰈(Cleisthenes herzensteini)和中間低鰭鯧(Peprilus medius)相應(yīng)的COⅢ基因序列，確認了所研究的鯧魚為鯧科、低鰭鯧屬（Peprilus）的中間低鰭鯧（Peprilus medius），而非

5、長鯧科（Centrolophidae）的刺鯧（Psenopsis anomala）、或鯧屬(Pampus)的銀鯧（Pampus argenteus）或灰鯧、鐮鯧等本地鯧。
　　選用COⅠ、COⅢ基因作為條形碼鑒定的魚種均與形態(tài)學鑒定的魚種吻合；COⅢ基因具有種間變異較大、種內(nèi)相對保守的特征，同樣可以作為分子標記鑒定海魚種類；采用PCR-RFLP技術(shù)能有效地區(qū)分以上10種海魚，限制性內(nèi)切酶NlaⅢ在10種魚的COⅠ基因上具有豐富的酶

6、切位點，用該種酶的單酶切即可將10種魚進行有效的區(qū)分；研究發(fā)現(xiàn)，在對COⅢ基因利用PCR-RFLP技術(shù)分析時，有些魚種會產(chǎn)生不同的酶切圖譜，表明COⅢ基因不適合用作高階元的分類標記，推測其可能更適合于用作物種內(nèi)不同群體間遺傳分化的分子標記。
　　依據(jù)測序結(jié)果設(shè)計的各魚種的特異引物特異性強，在適宜的退火溫度下，只有目標魚種有特異的擴增條帶，其他非目標魚種沒有擴增條帶；另外，采用復(fù)合PCR方法，以COⅠ或COⅢ基因為標記，實現(xiàn)了在一個