MT1-MMP(MMP-14)對侵襲性垂體腺瘤作用機制的研究.pdf

1、垂體腺瘤是良性腫瘤，但約1/3的腫瘤侵入海綿竇、蝶竇及斜坡等，稱之為侵襲性垂體腺瘤。除了垂體泌乳素腺瘤對溴隱亭治療敏感外，大多數(shù)垂體腺瘤的治療有賴于手術(shù)切除及術(shù)后放療。垂體腺瘤侵襲周圍組織造成手術(shù)全切除困難、術(shù)后易于復(fù)發(fā)等。垂體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，涉及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制劑、多種細胞因子等。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP，MMP-14)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，它能降解細胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜

2、，與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)在維持細胞基底膜完整性中共同發(fā)揮重要作用。因此，本文研究MT1-MMP(MMP-14)在侵襲性垂體腺瘤中作用的可能機制，以期由此干預(yù)垂體腺瘤的侵襲行為。
　　第一部分、侵襲性垂體腺瘤的評估
　　目的：
　　建立侵襲性垂體腺瘤(IPA)評估標(biāo)準(zhǔn)，獲取IPA組織標(biāo)本庫。
　　方法：
　　1.Hardy分級、分期法評估MRI垂體腺瘤的蝶竇侵襲，Knosp分類法評估MRI垂

3、體腺瘤的海綿竇侵襲；
　　2.根據(jù) MRI表現(xiàn)，將125例垂體腺瘤患者分為IPA58例及非侵襲性垂體腺瘤(NIPA)67例，以術(shù)中所見為依據(jù)，分析MRI判斷IPA的敏感性(Sen)、特異度(Spe)、陽性預(yù)測值(PPV)及陰性預(yù)測值(NPV)；
　　3.分析IPA的臨床特點。
　　結(jié)果：
　　1.MRI上分析垂體腺瘤侵襲蝶竇的敏感性為85.3％、陽性預(yù)測值為82.9%；Knosp0～Ⅰ級的垂體腺瘤，手術(shù)證實均為N

4、IPA，Sen及NPV均為100%，KnospⅢ級～Ⅳ級的垂體腺瘤術(shù)中證實為IPA，pe及PPV均為100%，NPV分別為93.8%及90.9%。
　　2.IPA中大腺瘤及巨大腺瘤的發(fā)生率高、手術(shù)全切除率低、垂體卒中及復(fù)發(fā)的發(fā)生率高。
　　3.功能性垂體腺瘤與無功能性垂體腺瘤中侵襲性的發(fā)生率接近，且功能性垂體腺瘤之間的IPA發(fā)生率無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　Knosp分類法評估IPA的準(zhǔn)確性高，術(shù)前MRI

5、表現(xiàn)結(jié)合術(shù)中所見能更好的評估IPA。
　　第二部分、MT1-MMP(MMP-14)在侵襲性垂體腺瘤中的表達及意義
　　目的：
　　檢測IPA組織中MT1-MMP(MMP-14)、VEGF、TGF-β、p53及PTTG的表達及相關(guān)性。
　　方法：
　　1.根據(jù)Knosp分類法，將82例垂體腺瘤患者分為IPA組37例、NIPA組45例，并將瘤周垂體組織3例作為對照組，運用實時定量PCR篩選IPA組織中MMPs(

6、MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-14、MMP-15)的基因表達譜，并檢測VEGF、TGF-β、p53及PTTG mRNA表達水平。
　　2.運用免疫組化檢測MT1-MMP(MMP-14)及MMP-2在IPA組織中蛋白表達水平。
　　3.將小鼠垂體腺瘤AtT-20細胞進行傳代培養(yǎng)，同樣應(yīng)用real-time PCR檢測AtT-20細胞中MMPs、VEGF、TGF-β、p53以及PTTG mRNA的表達，并與正常小鼠

7、垂體組織進行對照，進一步驗證MT1-MMP(MMP-14)與其他因子的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.MMPs基因表達譜及相關(guān)因子表達：IPA組織中MMP-1、2、9，MT1-MMP(MMP-14) mRNA的表達水平高于NIPA及瘤周垂體組織，且MT1-MMP(MMP-14) mRNA表達水平明顯增高(P＜0.001)，但MMP-15 mRNA無明顯改變(P＞0.05)；VEGF、TGF-β以及PTTG mRNA在IPA組織

8、中也高于其他兩組(P＜0.001)，但p53 mRNA無明顯改變(P＞0.05)。MT1-MMP(MMP-14)與VEGF、TGF-β、PTTG及MMP-1、2、9呈正相關(guān)(P＜0.05)，而與MMP-15及p53不相關(guān)(P＞0.05)。
　　2.免疫組化結(jié)果：IPA組織中MT1-MMP(MMP-14)、MMP-2的表達高于NIPA組，染色結(jié)果顯示MT1-MMP(MMP-14)主要位于細胞膜上；MMP-2主要表達于細胞基質(zhì)及胞漿內(nèi)

9、。
　　3.驗證MT1-MMP(MMP-14)與其他因子表達的相關(guān)性：AtT-20細胞中MT1-MMP(MMP-14)、VEGF、TGF-β以及PTTG mRNA的表達水平呈正相關(guān)，且高于對照組（p＜0.001），而MMP-2、MMP-9、MMP-15及p53mRNA無明顯改變（p＞0.05），進一步驗證了MT1-MMP(MMP-14)參與垂體腺瘤侵襲過程的可能性。
　　結(jié)論：
　　MT1-MMP(MMP-14)在IP

10、A中高表達，且與VEGF、TGF-β及PTTG mRNA呈正相關(guān)，提示MT1-MMP(MMP-14)在垂體腺瘤侵襲及血管生成過程中有著重要作用。
　　第三部分、干擾MT1-MMP(MMP-14)對小鼠垂體腺瘤侵襲行為的影響
　　目的：
　　構(gòu)建MT1-MMP(MMP-14)干擾載體，瞬時轉(zhuǎn)染AtT-20細胞，探討MT1-MMP(MMP-14)在小鼠垂體腺瘤侵襲過程中的作用及可能機制。
　　方法：
　　1.M

11、T1-MMP(MMP-14)高效siRNA表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：依據(jù)干擾載體設(shè)計原則選取四條可能的序列作為目標(biāo)序列(MMP14-mus-1050、1246、1358 and537)，將目的片段構(gòu)建 pGPU6/GFP/Neo-MMP-14干擾載體；并將構(gòu)建的pGPU6/GFP/Neo-MMP-14四個不同siRNA表達載體用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染至小鼠垂體腺瘤AtT-20細胞。通過real-time PCR篩選出效率最高的干擾載體；48h后通過

12、熒光顯微鏡進一步檢測其轉(zhuǎn)染效率。
　　2.MT1-MMP(MMP-14)基因沉默：運用real-time PCR檢測MT1-MMP(MMP-14)高效siRNA表達載體對AtT-20細胞中MMPs(MMP-2、9、15)、VEGF、TGF-β、p53及PTTG mRNA表達水平的影響。
　　3.TIMP-1處理AtT-20細胞對MMPs、血管因子及與腫瘤相關(guān)因子mRNA及蛋白表達水平的影響：將培養(yǎng)狀態(tài)良好的AtT-20細胞分

13、為三組①對照組：條件培養(yǎng)基；②處理組A：條件培養(yǎng)基+10μmol/mL TIMP-1蛋白；③處理組B：條件培養(yǎng)基+50μmol/mL TIMP-1蛋白。Real-time PCR檢測不同濃度TIMP-1蛋白處理AtT-20細胞對MMPs、血管因子及與腫瘤相關(guān)因子mRNA表達水平；Western blot檢測不同濃度的TIMP-1對MT1-MMP(MMP-14)及MMP-2表達的影響。
　　4. TIMP-1蛋白處理 AtT-20細

14、胞后侵襲能力的改變：在AtT-20細胞中分別加入10μmol/mL及50μmol/mL TIMP-1，利用AtT-20細胞穿過Matrigel膠的數(shù)目，判斷不同濃度TIMP-1對AtT-20細胞侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建MT1-MMP(MMP-14) siRNA表達載體：Real-time PCR檢測四種干擾載體MMP14-mus-1050、1246、1358及537，并與對照組比較，其mRNA表達受到四

15、個載體不同程度的抑制，其中 MMP14-mus-1246組的抑制效率最為明顯，且pGPU6/GFP/Neo-siT1-1246細胞的綠色熒光蛋白表達率達到70%以上；重復(fù)實驗后，選擇該組高效干擾表達載體用于下一步實驗。
　　2.構(gòu)建瞬時沉默細胞模型：MT1-MMP(MMP-14)-siRNA表達載體瞬時轉(zhuǎn)染入AtT-20細胞，real-time PCR結(jié)果顯示：干擾組PTTG、VEGF、TGF-β、MMP-9 mRNA表達明顯降低

16、，而MMP-2、MMP-15及p53改變不明顯；
　　3. TIMP-1蛋白處理AtT-20細胞：高濃度TIMP-1可以明顯降低AtT-20細胞中MT1-MMP(MMP-14) mRNA表達，同時VEGF、TGF-β及PTTG mRNA表達下調(diào)。Western blot結(jié)果顯示：低濃度TIMP-1可以抑制MT1-MMP(MMP-14)蛋白表達，而MMP-2改變不明顯；高濃度TIMP-1雖然可以抑制MMP-2，但對MT1-MMP(M

17、MP-14)抑制效果更好。
　　4. TIMP-1蛋白處理AtT-20細胞后侵襲能力的改變：AtT-20細胞經(jīng)TIMP-1蛋白處理后，隨著TIMP-1濃度增加且時間延長其侵襲能力明顯下降。高濃度TIMP-1可以使MT1-MMP(MMP-14)下調(diào)從而影響其侵襲、遷移能力。
　　結(jié)論：
　　MT1-MMP(MMP-14)參與調(diào)控PTTG及VEGF，在垂體腺瘤侵襲中發(fā)揮重要作用。TIMPs可以抑制MT1-MMP(MMP-1