低水平鉛暴露對(duì)不同發(fā)育期大鼠學(xué)習(xí)記憶及mGlur1、NMDA受體表達(dá)的影響.pdf

1、隨著社會(huì)工業(yè)進(jìn)程和現(xiàn)代化步伐的加快，工業(yè)垃圾不斷傾倒危險(xiǎn)品對(duì)土壤和水體造成嚴(yán)重污染，其中鉛由于在土壤中的持續(xù)蓄積和對(duì)農(nóng)產(chǎn)品、人體健康的高毒性，而受到越來(lái)越多的關(guān)注。鉛作為一種常見(jiàn)的金屬毒物，對(duì)人體多種組織、器官造成損害，尤其對(duì)發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，具有興奮性神經(jīng)毒性。它對(duì)認(rèn)知能力影響而引起巨大的公眾健康問(wèn)題。鉛可以通過(guò)胎盤向胎兒轉(zhuǎn)運(yùn)，并通過(guò)胎兒發(fā)育尚不完善的血腦屏障，進(jìn)入胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育造成損害進(jìn)而影響胎

2、兒出生后的學(xué)習(xí)記憶能力；也可以通過(guò)乳汁進(jìn)入新生兒體內(nèi)，造成嬰幼兒鉛負(fù)荷升高；早期鉛暴露還將影響兒童和青春期智發(fā)育，并且這些影響將持續(xù)到成年以后。 在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生過(guò)程，海馬是負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，特別是短期記憶和近期記憶。海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)（Long term potentiation，LTP）被認(rèn)為是海馬學(xué)習(xí)和記憶的儲(chǔ)存功能單位。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)特定受體——谷氨酸觸發(fā)了LTP。 N-甲基-D-天冬氨酸受體（N–m

3、ethyl-D-aspartate Receptors，NMDARs）是一種興奮性氨基酸受體亞單位，在腦的發(fā)育、學(xué)習(xí)與記憶機(jī)制中起重要作用。NMDARs作為一個(gè)雙向受體，可檢測(cè)到突觸受體釋放谷氨酸，突觸后去極化，使Mg2+阻滯作用消失，通道開(kāi)放，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，激活一系列酶作用反應(yīng)，同時(shí)這些又是構(gòu)成LTP誘導(dǎo)和維持的物質(zhì)基礎(chǔ)。NMDAR表達(dá)存在選擇性，主要功能和特性差異源于NR2亞基的不同表達(dá)和分布，故此測(cè)定NR2。NR2在神經(jīng)細(xì)胞生

4、長(zhǎng)發(fā)育、突觸傳遞、LTP、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程中起著重要作用。 生長(zhǎng)發(fā)育期腦NMDAR是鉛作用的重要目標(biāo)，鉛是NMDAR的非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑。離體海馬神經(jīng)元電生理研究發(fā)現(xiàn)，鉛能抑制NMDA激活的全細(xì)胞電流，抑制NMDAR單通道的開(kāi)放頻率，且其抑制作用的強(qiáng)度與神經(jīng)元的成熟程度有關(guān)，幼稚神經(jīng)元對(duì)鉛的抑制作用更加敏感。但目前還不清楚鉛影響NMDA受體mRNA表達(dá)的機(jī)理，以及暴露水平與影響之間的具體關(guān)系。 代謝性谷氨酸受體（

5、Metabotropic glutamate receptors，mGluR）是G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR），依據(jù)序列的同源性、受體的藥理學(xué)特性及其所偶聯(lián)的細(xì)胞內(nèi)第二信使的不同超家族，將8個(gè)受體分為中分為三組。代謝性谷氨酸受體亞型1（mGlur1）屬于I組，是GPCRs家族的重要成員可能在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用、學(xué)習(xí)記憶突觸的形成和維持、神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用，可引起強(qiáng)烈的興奮

6、性神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元的腫脹和壞死，和神經(jīng)退行性病變有關(guān)，并參與了LTP過(guò)程，但具體機(jī)理尚不清楚。I組受體和蛋白激酶C偶聯(lián)，增強(qiáng)NMDA受體通道的開(kāi)放。mGluR介導(dǎo)的NMDAR活性增強(qiáng)在突觸傳遞和突出可塑性，包括LTP過(guò)程中起重要作用。 眾所周知，鉛毒性通過(guò)活性氧族產(chǎn)物誘發(fā)氧化損傷，包括超氧離子（O2-），羥基（-OH）和過(guò)氧化氫（H2O2）。這些自由基和過(guò)氧化物引起膜損傷，常與脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)，影響發(fā)育時(shí)期暴露于鉛的大鼠中樞神

7、經(jīng)系統(tǒng)。值得注意的是，染鉛后大鼠腦組織內(nèi)可觀察到脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，以及抗氧化酶如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽超氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活性降低。 一氧化氮（Nitric oxide，NO）被認(rèn)為是典型的逆行信使分子，在學(xué)習(xí)和記憶中起到重要作用，其生物合成主要受一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）的調(diào)節(jié)，目

8、前多是以NOS活性來(lái)反映NO的水平。而鉛對(duì)NOS活性有抑制作用，可使NO減少甚至消失。 目的： 本研究通過(guò)建立一系列在生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的不同階段低水平大鼠鉛暴露模型，檢測(cè)鉛在子代全血和腦組織中的濃度，全血δ-ALAD活性，及不同腦組織中mGlur1、NMDAR亞單位mRNA，SOD，GSH-Px，NOS活性。從一個(gè)廣泛的角度研究各項(xiàng)指標(biāo)變化與鉛暴露濃度、暴露時(shí)間之間的關(guān)系，為鉛損傷對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能及神經(jīng)行為的改變的研究提供一定

9、的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步探討醋酸鉛的神經(jīng)毒作用機(jī)制。 方法： 1.在不同發(fā)育階段，采用0.2％的醋酸鉛溶液自由飲水作為處理因素，建立鉛暴露的動(dòng)物模型，設(shè)立正常對(duì)照組、孕期暴露組（A組）、哺乳期鉛暴露組（B組）、斷乳后鉛暴露組（C組）。于PND60取材，測(cè)量體重及腦重，海馬、雙側(cè)皮質(zhì)的重量。 2.用石墨爐-原子吸收光譜法測(cè)定血腦組織中鉛的含量；用分光光度計(jì)測(cè)量全血ALAD，評(píng)價(jià)鉛吸收程度。 3.以Morris水迷

10、宮檢測(cè)不同發(fā)育階段鉛暴露后動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。 4.用半定量RT-PCR方法，結(jié)合技術(shù)圖像分析系統(tǒng)，檢測(cè)皮層、海馬組織中mGlur1及NMDA相關(guān)受體mRNA表達(dá)量，比較不同時(shí)期染毒的變化，觀察醋酸鉛對(duì)大鼠腦組織mGlur1及NMDA受體表達(dá)的影響。 5.測(cè)定腦組織中的過(guò)氧化物酶指標(biāo)，SOD，GSH-Px和NOS，探討鉛對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的氧化損傷機(jī)制。 結(jié)果： 1.與對(duì)照組相比，染毒劑量組的大鼠體重、腦

11、體重比率差異無(wú)顯著性（P>0.05），不同時(shí)期染毒組之間差異無(wú)顯著性（P>0.05）。相對(duì)于對(duì)照組，A組的腦重、海馬重量，B組的腦重有顯著性減少（P<0.01），A組的皮質(zhì)重量大于B、C組（P<0.01）。 2.醋酸鉛處理后，各劑量染鉛組大鼠相對(duì)于對(duì)照組全血、皮層、海馬組織中鉛含量顯著增加，ALAD活力下降，差異有顯著性。A組：與對(duì)照組相比，腦鉛含量有顯著性增加（P<0.01）；B組：與對(duì)照組相比，血鉛升高、ALAD含量降低，差

12、別有顯著性（P<0.01，P<0.05）；C組：與對(duì)照組相比，仔鼠的血鉛、腦鉛、ALAD含量改變顯著，差別有顯著性（P<0.01，P<0.05）。 3.在Morris水迷宮測(cè)試中，第1天各組動(dòng)物的測(cè)試成績(jī)之間無(wú)顯著性差異，從第2天起，各染鉛組仔鼠的逃避潛伏期（Escape Latency）值均高于對(duì)照組，其差別有顯著性（P<0.05，P<0.01）。雖然在訓(xùn)練過(guò)程中各染鉛組的成績(jī)有所提高，但各染鉛組后3天的潛伏期曲線始終無(wú)法恢復(fù)

13、到正常水平，尤其是C組相對(duì)于對(duì)照組以及其它各組在各象限都有顯著性差異（P<0.05）。與對(duì)照組相比，A組在第I象限，B組在第I、IV象限的潛伏期時(shí)間差異顯著（P<0.05）。但是A組在第II、IV象限的潛伏期時(shí)間和對(duì)照相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 4.RT-PCR結(jié)果顯示，染毒組NR2AmRNA在海馬和皮層中表達(dá)較對(duì)照組有不同程度升高，尤其在A組中的表達(dá)大于其他各組，有顯著性差異（P<0.05）；各染毒組NR2BmRNA在

14、海馬表達(dá)較對(duì)照組有不同程度的下降，并有顯著性差異（P<0.05），B組的受體在皮質(zhì)中表達(dá)量與對(duì)照有顯著性差異（P<0.05）；NR2CmRNA在皮質(zhì)中的表達(dá)與對(duì)照沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），A組NR2CmRNA在海馬中較對(duì)照組表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對(duì)照組相比，A組在皮質(zhì)、海馬中，以及B組在皮質(zhì)中的mGlur1受體表達(dá)減少，C組正好相反，受體表達(dá)不論在皮質(zhì)還是海馬中均高于對(duì)照組，兩組結(jié)果都具有顯著性差異（P<

15、0.01）。 5.過(guò)氧化物酶測(cè)定結(jié)果顯示，不同時(shí)期染毒組SOD活性呈波形趨勢(shì)，A、B組較對(duì)照組不同程度升高，其中B組與對(duì)照組、C組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），C組較對(duì)照組SOD活性降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；各染毒組GSH-Px活性較對(duì)照組有不同程度升高，尤其B組與對(duì)照組、A組差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；NOS活性染毒組較同時(shí)期對(duì)照組有不同程度下降，C組與對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.

16、05）。 結(jié)論： 1.醋酸鉛處理后，鉛在各染毒組大鼠全血、海馬、皮質(zhì)組織中的含量顯著增加，ALAD活性降低。停止鉛暴露后，腦組織中的鉛含量隨年齡增長(zhǎng)濃度不斷下降。 2.低濃度的鉛暴露對(duì)學(xué)習(xí)記憶造成損傷，且損傷將一直持續(xù)到成年。 3.孕鼠血中的鉛可以通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎鼠，也可通過(guò)發(fā)育尚不完善的血腦屏障到達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)。在哺乳階段鉛可通過(guò)乳汁在子代體內(nèi)蓄積。通過(guò)上述一系列途徑，醋酸鉛可干擾其子代神經(jīng)系統(tǒng)的正常生長(zhǎng)

17、發(fā)育，進(jìn)而影響仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并且這種損害作用將持續(xù)到仔鼠的成熟期。 4.鉛可改變腦組織中mGlur1和NMDAR受體mRNA的表達(dá)，尤其是低濃度鉛暴露使生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的大鼠腦組織中NR2BmRNA的表達(dá)降低，同時(shí)可觀察到學(xué)習(xí)記憶能力的下降，所以可以推測(cè)mGlur1和NMDAR受體可能是鉛神經(jīng)毒性的機(jī)制之一。 5.不同發(fā)育期醋酸鉛暴露可使腦組織中抗氧化酶類活性升高將加重腦損傷。同時(shí)NOS活性的降低可推斷NO生成減少，可