表觀遺傳介導(dǎo)發(fā)育期BPA暴露致大鼠胰腺發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶受損的研究.pdf

1、英國(guó)科學(xué)家David J. P. Baker在1995年首次提出了“成人疾病的胎兒起源”（Fetal Origins of Adult Disease，F(xiàn)OAD）假說(shuō)，后來(lái)逐漸演變成了如今的“健康和疾病的發(fā)育起源”（Developmental Origins of Health and Disease，DOHaD）假說(shuō)。該假說(shuō)認(rèn)為人類(lèi)在早期發(fā)育過(guò)程中（包括胎兒、嬰兒、兒童時(shí)期）經(jīng)歷不利因素，組織器官在結(jié)構(gòu)和功能上會(huì)發(fā)生永久性或程序性改變

2、，將會(huì)影響成年期糖尿病、代謝綜合征、心血管疾病、精神行為異常等慢性非傳染性疾病的發(fā)生發(fā)展。內(nèi)分泌干擾物，作為廣泛存在的環(huán)境污染物，其發(fā)育期暴露對(duì)器官系統(tǒng)的發(fā)育毒性及與成年期疾病易感性的關(guān)系已引起越來(lái)越多的關(guān)注。
　　雙酚 A（BPA），是目前世界范圍內(nèi)制造和使用量最多的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一。作為單體分子，BPA主要用于生產(chǎn)制造聚碳酸酯和環(huán)氧樹(shù)脂等可用于食品和飲料包裝的高分子材料。BPA暴露主要經(jīng)由食品包裝和飲料容器中滲入到食物中從

3、而經(jīng)口攝入，其他如皮膚接觸和呼吸攝入等也是重要暴露途徑。而且，研究表明BPA可以經(jīng)過(guò)胎盤(pán)和母乳傳遞給胎兒和新生兒，對(duì)人類(lèi)健康形成嚴(yán)重威脅。動(dòng)物研究和人群流行病學(xué)研究都表明發(fā)育期暴露于 BPA可改變成年期神經(jīng)行為包括學(xué)習(xí)/記憶和情緒調(diào)節(jié)，但是其潛在的機(jī)制尚不明確。前期研究同樣表明發(fā)育期BPA暴露可增加成年期糖尿病易感性，且機(jī)制同樣尚不明確。
　　本研究首先從胰腺發(fā)育的角度探討大鼠發(fā)育期暴露于 BPA致成年期糖代謝紊亂的可能途徑，及其

4、中潛在的表觀遺傳機(jī)制。本研究接著探討發(fā)育期暴露于BPA對(duì)成年期大鼠學(xué)習(xí)記憶和焦慮行為的影響，以及對(duì)控制相應(yīng)行為的大腦區(qū)域內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的影響，并探討潛在的表觀遺傳機(jī)制。
　　第一部分表觀遺傳介導(dǎo)BPA發(fā)育期暴露干擾大鼠胰腺發(fā)育并誘導(dǎo)成年期糖代謝紊亂
　　目的：探討發(fā)育期暴露于低劑量BPA對(duì)胰腺內(nèi)β細(xì)胞早期發(fā)育的影響，及與此有關(guān)的控制胰腺發(fā)育的關(guān)鍵基因的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，探討 BPA暴露引起的早期胰腺發(fā)育受損潛在的表觀遺傳機(jī)制

5、及對(duì)成年期糖代謝的影響。
　　方法：將受孕的Wistar大鼠按體重匹配后隨機(jī)分成對(duì)照組和BPA暴露組。從妊娠第一天開(kāi)始，每天經(jīng)口給予暴露組孕鼠10μg/kg體重的BPA，對(duì)照組給予相應(yīng)的溶劑對(duì)照玉米油。大鼠出生后，利用免疫組化和定量PCR檢測(cè)胰腺β細(xì)胞發(fā)育及關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)；在此基礎(chǔ)上，分離胚胎15.5天胰腺觀察胰腺發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)；大鼠出生后至成年，利用葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)，順序觀察糖代謝情況；從胚胎期至成年，利用

6、染色質(zhì)免疫共沉淀和質(zhì)譜法，持續(xù)測(cè)定胰腺發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵調(diào)控基因的組蛋白修飾和DNA甲基化改變。
　　結(jié)果：胚胎期暴露于10μg/kg/d BPA可降低出生時(shí)仔鼠胰腺β細(xì)胞質(zhì)量（Beta-cell mass, BCM），并降低胰腺發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因胰十二指腸同源盒1（pancreatic duodenal homeobox-1，Pdx1）的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BPA對(duì)胰腺Pdx1表達(dá)的影響在妊娠15.5天既已出現(xiàn)，表現(xiàn)為胰腺內(nèi) PDX

7、1陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)降低。BPA暴露在胚胎期顯著改變Pdx1啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白修飾，使之表達(dá)失活；主要表現(xiàn)為組蛋白H3和H4乙?；档停M蛋白H3第4位賴(lài)氨酸三甲基化降低和9位賴(lài)氨酸雙甲基化升高；且此種失活調(diào)節(jié)趨勢(shì)可隨著胎兒生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行性加深，直至成年期；然而，本研究中 Pdx1基因啟動(dòng)子區(qū)域 DNA甲基化檢測(cè)未見(jiàn)明顯改變；母體BPA暴露最終使成年期子代發(fā)生糖代謝紊亂。
　　結(jié)論：發(fā)育期暴露于BPA可顯著改變胰腺發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因Pdx1

8、啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白修飾，使之向失活狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而影響早期胰腺β細(xì)胞發(fā)育，最終在成年期引起糖代謝紊亂。
　　第二部分 BPA發(fā)育期暴露損害大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬區(qū)雌激素受體α的DNA甲基化
　　目的：探討發(fā)育期暴露于雙酚A（BPA）對(duì)子代大鼠學(xué)習(xí)記憶行為和情緒調(diào)節(jié)及探索行為的影響，并探討其中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　方法：將受孕的Sprague-Dawley（SD）大鼠按體重匹配后隨機(jī)分成對(duì)照組和BPA暴露組。從妊娠第一天

9、開(kāi)始至出生后21天斷乳，每天灌胃給予暴露組大鼠40μg/kg體重的BPA，對(duì)照組給予相應(yīng)的溶劑對(duì)照玉米油。子代大鼠出生后60天，利用Morris水迷宮測(cè)定大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；子代大鼠出生后85天，利用高架十字迷宮測(cè)定大鼠的焦慮和探索行為；應(yīng)用 ELISA方法測(cè)定大鼠血清中的皮質(zhì)酮濃度，同時(shí)應(yīng)用定量PCR法測(cè)定子代大鼠海馬組織中雌激素受體α和雌激素受體β的表達(dá)水平；最后測(cè)定子代大鼠海馬中雌激素受體α的基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)，探討 BPA

10、暴露影響子代大鼠學(xué)習(xí)記憶行為發(fā)育的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　結(jié)果：水迷宮實(shí)驗(yàn)中，發(fā)育期暴露于 BPA首先顯著延長(zhǎng)了雌雄子代大鼠在獲得性訓(xùn)練中找到潛伏平臺(tái)的時(shí)間，其次在探查訓(xùn)練中降低了子代大鼠出現(xiàn)在目標(biāo)象限的時(shí)間。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，發(fā)育期暴露于 BPA沒(méi)有在子代大鼠中產(chǎn)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的行為改變；但是，BPA暴露子代大鼠血清中的皮質(zhì)酮濃度相比于對(duì)照組子代大鼠顯著升高，且此種改變呈現(xiàn)出性別特異性。相對(duì)于對(duì)照組，發(fā)育期暴露于BPA顯著降低了