甲基汞對不同發(fā)育期大鼠NMDA受體表達及學習記憶的影響.pdf

1、汞是一種廣泛存在于自然界的重金屬，主要以無機汞及有機汞兩種形式存在。自然界中的無機汞可存在于環(huán)境中的各種介質(zhì)（空氣、水、土壤）中并在其中通過生物鏈進行循環(huán)和富集，其毒性也隨之增加，人類作為食物鏈的終端，也成為了甲基汞的最大受害者。上世紀60年代在日本發(fā)生的水俁病以及70年代伊拉克的甲基汞毒性事件讓人們開始認識到并逐漸重視甲基汞的神經(jīng)毒性。 甲基汞因為脂溶性高，易于通過胎盤屏障和血腦屏障，進入胎兒腦組織，使其腦細胞發(fā)生退行性變，對

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆的損害，影響視覺、聽覺功能，引起神經(jīng)行為改變，對學習記憶能力產(chǎn)生損害。胎兒體內(nèi)的甲基汞含量總高于母體，且在母體未出現(xiàn)任何癥狀時，胎兒可能研究出現(xiàn)了明顯癥狀。因此，妊娠期甲基汞中毒一直受到研究者的關(guān)注，在這方面也有大量研究。但出生后，嬰兒的大腦仍然處于發(fā)育期，并可以通過母乳接觸和吸收甲基汞，因此該時期的中CNS對甲基汞的神經(jīng)毒性非常敏感。對出生后各時期的甲基汞神經(jīng)毒性的研究也十分有意義。高劑量的甲基汞可以引起顯著的神

3、經(jīng)系統(tǒng)疾病，但中低劑量的甲基汞暴露一般癥狀并不明顯，而以神經(jīng)行為學作為評判標準。本研究擬選擇出生后不同發(fā)育期大鼠，低劑量甲基汞急性染毒，觀察其學習記憶能力的改變，并探討與其相關(guān)的分子機制。 甲基汞可抑制谷氨酸重吸收減少，NMDA受體的活化可引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，ROS生成增加，對腦組織造成氧化損傷，同時NOS活化生成NO，作為逆行信號分子活化突觸前膜的NMDA受體，Na+，Ca2+通道開放，影響長時程增強（LTP）的形成，

4、從而影響學習記憶功能。NMDA受體是中樞許多突觸產(chǎn)生去極化信號的主要基礎，參與多種形式的神經(jīng)元可塑性改變,可導致學習、記憶、行為障礙，在大腦的發(fā)育和成熟過程中扮演了重要角色。NMDA 受體有NR 1和NR 2、NR3三種亞基，其中NR2 亞單位又可分為NR2A～D 四個亞型，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的不同時期，NMDA 受體亞型的表達存在選擇性。NMDA受體主要有1個NR1亞基與NR2構(gòu)成異構(gòu)體，因此可推斷NMDA受體的主要功能特性的差異源于

5、NR2亞基的不同表達。 本研究擬觀察不同時期甲基汞染毒對大鼠腦組織（海馬和大腦皮層）NMDA受體2亞基表達的影響，同時測定腦組織中SOD、GSH-Px還原性酶活性及NOS活性，觀察腦組織中氧化損傷程度，探討出生后甲基汞暴露對NMDA受體表達影響、氧化損傷與學習記憶之間的聯(lián)系。 本研究分為三個部分： 第一部分、甲基汞暴露對不同發(fā)育期大鼠學習記憶能力的影響 目的：檢測甲基汞暴露對不同發(fā)育期大鼠學習記憶能力的影

6、響。 方法：對出生后不同時期（PND7、PND14、PND28、PND60）大鼠連續(xù)7天氯化甲基（MMC）汞染毒，正常飼養(yǎng)至成年進行水迷宮測試，觀察其學習記憶改變。分別取染毒結(jié)束后第三天及水迷宮測試后大鼠腦組織，采用原子熒光光度計檢測腦組織汞含量。 結(jié)果：染毒結(jié)束后，染毒組大鼠腦組織汞含量明顯高于對照組；不同年齡階段甲基汞在海馬組織中蓄積高于大腦皮層，但差異不具有統(tǒng)計學意義；染毒結(jié)束正常飼養(yǎng)至成年，汞隨著年齡增長會逐漸被

7、分解減少，出生早期（PND7、PND14）染毒大鼠腦組織汞含量與對照組差異無統(tǒng)計學意義，僅PND28皮層組織及PND60與對照組差異有統(tǒng)計學意義；空間學習能力測試結(jié)果顯示出生PND7、PND14染毒大鼠水迷宮測試潛伏期差明顯長與對照組，PND28、PND60染毒組大鼠潛伏期與對照組差異不顯著。 結(jié)論：脫離汞環(huán)境，隨時間改變腦組織汞含量會逐漸降低，但出生后第一、二周接觸甲基汞對明顯影響了大腦學習記憶功能，且這種損傷不具有可逆性；同

8、樣濃度的汞對PND28、PND60的大鼠學習記憶能力影響不大。 第二部分、甲基汞暴露對不同發(fā)育期大鼠腦組織的氧化還原酶的影響 目的：甲基汞暴露對不同時期大鼠腦組織抗氧化酶SOD、GSH-Px及NOS活性改變，探討其與學習記憶的關(guān)系。 方法：取染毒結(jié)束后第三天腦組織勻漿液，使用試劑盒檢測SOD、GSH-Px、NOS活性。 結(jié)果：染毒組SOD活性較對照組不同程度下降，PND7、PND14海馬、皮層組織染毒組與

9、對照組差異具有統(tǒng)計學意義，PND28海馬組織染毒組與對照組差異具有統(tǒng)計學意義；染毒組GSH-P活性較同時期對照組有不同程度下降，其中PND14、PND60海馬組織與對照組差異具有統(tǒng)計學意義，皮層組織中各時期染毒組與對照組差異具有統(tǒng)計學意義；NOS活性染毒組較同時期對照組有不同程度增加，海馬組織中PND7、PND14、PND28染毒組與對照組差異具有統(tǒng)計學意義；皮層組織中各時期染毒組與對照組差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論：不同時期甲基

10、汞暴露造成腦組織內(nèi)還原性酶類活性下降，尤其是發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化損傷能力更差；NOS活性增加即腦組織內(nèi)NO生成增加，可造成進一步的氧化損傷，同時可活化突觸膜NMDA受體相關(guān)，造成興奮性神經(jīng)毒性，影響LTP的形成。這些改變可一定程度上解釋發(fā)育中學習記憶的改變。 第三部分、甲基汞暴露對不同發(fā)育期大鼠腦組織NMDA受體2亞基表達的影響 目的：觀察甲基汞暴露對不同發(fā)育期大鼠NMDA受體2亞基mRNA水平表達的影響，探討其與學習

11、記憶損傷之間的關(guān)系。 方法：染毒結(jié)束后第3天分別取海馬、大腦皮層組織，提取總RNA，RT-PCR特異性擴增NMDA受體2A、2B、2C亞基，以β-actin為內(nèi)參，半定量分析PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果。 結(jié)果：染毒組NR2AmRNA在海馬和皮層中表達較對照組有不同程度下降，尤其PND14亞組差異具有統(tǒng)計學意義；染毒組NR2BmRNA在海馬中表達較對照組有顯著下降，PND7、PND14、PND28亞組差異具有統(tǒng)計學意義，在皮層

12、中的表達PND7亞組差異具有統(tǒng)計學意義；染毒組NR2CmRNA在海馬和皮層較對照組表達增加，其中海馬組織中PND14亞組差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論：染毒組大鼠腦組織尤其是海馬組織NMDA受體2亞基mRNA表達發(fā)生了顯著變化，特別是大腦發(fā)育早期，這種改變一定程度上造成了甲基汞對學習記憶能力的損害。 本研究的主要結(jié)論： 1)本研究對出生后不同發(fā)育期大鼠低劑量甲基急性汞暴露，發(fā)現(xiàn)各發(fā)育期甲基汞在腦組織中蓄積程度差異不大

13、，PND14亞組海馬組織中甲基汞濃度略高于皮層；隨年齡增長，腦組織中甲基汞濃度不斷下降，甚至降至與對照組無異，但僅出生早期(尤其是PND14)甲基汞暴露對大鼠的學習記憶造成損傷，且損傷一直持續(xù)到成年。 2)不同發(fā)育期甲基汞暴露可使腦組織中抗氧化酶類活性降低，發(fā)育早期尤為顯著，可推測甲基汞引起的氧化應激對大鼠的學習記憶的形成造成影響；同時NOS活性的增加可推斷NO生成增加，一方面可以與ROS反應生成氧化毒性更大的ONNO-，另一方