FAM83D上調(diào)CD44表達促進肝細胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力的機制研究.pdf

1、背景:
　　原發(fā)性肝細胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的高致死率惡性腫瘤，也是我國最主要的公共健康問題之一。雖然目前在針對HCC的早期篩查、診斷、手術技術等方面取得了明顯進步，并顯著延長了HCC患者的生存時間和改善了生存質(zhì)量，但是HCC的高轉(zhuǎn)移率和術后高復發(fā)率始終限制著總體生存率的提高。如何有效防治術后復發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為迸一步改善HCC患者生存預后的關鍵問題。基因組突變和重組是HCC獲得

2、更強異質(zhì)性以及包含干細胞特性、高度耐藥性等惡性能力的原始動力，在增強HCC細胞生存能力中起重要作用。全面解讀HCC腫瘤基因組發(fā)生的突變、結(jié)構(gòu)異常、染色體重構(gòu)以及拷貝數(shù)變異等信息可為揭示HCC復發(fā)轉(zhuǎn)移分子機制的研究提供重要線索，并促進早診分子標記物與精準治療靶標的發(fā)現(xiàn)。
　　目的:
　　本研究旨在借助高通量RNA測序技術對HCC組織和相應的癌旁組織進行轉(zhuǎn)錄組的解讀，尋找與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關的關鍵癌基因。擴大樣本重點驗證候選

3、癌基因FAM83D在HCC患者中的表達模式以及臨床意義。體外構(gòu)建FAM83D敲減細胞株，明確FAM83D在維持HCC細胞干性中的作用。最后，借助基因芯片和蛋白質(zhì)譜實驗闡明FAM83D調(diào)控HCC復發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在分子機制。
　　材料與方法:
　　1.通過高通量RNA測序和生物信息學分析篩選HCC組織與相應癌旁組織間的差異表達基因。
　　2.收集150對HCC患者腫瘤組織、配對癌旁組織以及臨床病理信息，利用免疫組織化學、實時熒

4、光定量PCR等方法驗證候選基因FAM83D在HCC組織及癌旁組織中的表達模式，分析FAM83D在HCC組織中的表達水平與患者腫瘤病理參數(shù)、生存預后之間的相關性。
　　3.通過體外轉(zhuǎn)染FAM83D-siRNA慢病毒構(gòu)建FAM83D敲減HCC細胞株，借助懸浮球細胞培養(yǎng)實驗、流式細胞儀表面蛋白表達量分析實驗、Western免疫印跡實驗檢測FAM83D對HCC細胞干性能力、腫瘤干細胞標志物表達、腫瘤干細胞擴增的影響;利用裸鼠體內(nèi)成瘤實驗和

5、細胞侵襲實驗觀察FAM83D對HCC細胞成瘤、轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　4.降低HCC細胞株FAM83D表達后，利用轉(zhuǎn)錄組基因芯片實驗進行差異表達基因的篩選，通過GO和KEGG分析初步探索FAM83D參與HCC細胞干性調(diào)控的潛在分子機制。
　　5.通過信號通路小分子抑制劑抑制實驗和CD44-siRNA轉(zhuǎn)染實驗驗證CD44與MAPK、TGF-β以及Hippo通路之間的相互調(diào)節(jié)關系，利用蛋白免疫共沉淀實驗和質(zhì)譜分析明確FAM83D調(diào)

6、控上述信號通路的關鍵上游分子。
　　結(jié)果:
　　1.通過對10對HCC樣本患者的高通量RNA測序，共篩選得到HCC組織及癌旁組織間差異表達基因544個（倍數(shù)改變＞2，P＜0.01），其中321個過表達基因，223個為低表達基因。FAM83D在9對HCC樣本中表達水平顯著增高，平均表達增高倍數(shù)超過8倍。
　　2.在擴大驗證的150對HCC樣本中，qRT-PCR和免疫組織化學實驗結(jié)果證實FAM83D在HCC組織中的表達水平

7、顯著高于配對癌旁組織(P＜0.01)。高表達FAM83D與HCC患者惡性腫瘤生物學特征正相關，如腫瘤低分化、血清高AFP水平、門靜脈侵犯、腫瘤數(shù)目＞3等。與FAM83D低表達組相比，F(xiàn)AM83D高表達患者擁有更高的肝移植術后腫瘤復發(fā)率和更短的無瘤生存時間。
　　3.體外細胞干性實驗證實HCC細胞株敲減FAM83D后，顯著抑制了CD44s和CD44v分子的表達以及懸浮球形成能力。體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)FAM83D后可顯著抑制HCC細胞

8、株的成瘤能力、腫瘤轉(zhuǎn)移能力以及肺克隆能力。
　　4.轉(zhuǎn)錄組基因芯片結(jié)果提示FAM83D下調(diào)后可引起1565個基因出現(xiàn)差異表達（倍數(shù)＞2，P＜0.01），主要分布于MAPK、TGF-β以及Hippo等信號通路。敲減FAM83D表達后，ERK1/2、Smad2磷酸化水平下降，YAP表達水平受到抑制，YAP磷酸化水平相對增高。
　　5.MAPK、TGF-β以及Hippo信號通路抑制后，可顯著下調(diào)CD44分子的表達;干擾CD44表達

9、后，ERK1/2、Smad2磷酸化、YAP表達水平下降，YAP磷酸化水平相對增高，提示CD44與上述信號通路存在互相調(diào)節(jié)作用。
　　6.蛋白免疫共沉淀實驗和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)RAP1為FAM83D調(diào)控MAPK、TGF-β以及Hippo信號通路的關鍵上游分子。
　　結(jié)論:
　　1.相對于癌旁組織，F(xiàn)AM83D在HCC組織的表達水平明顯升高，并與惡性腫瘤生物學行為和不良預后相關。
　　2.敲減FAM83D可顯著抑制CD4