Erk1-2信號通路在七氟烷后處理減輕缺血再灌注大鼠皮質神經元凋亡中的作用.pdf

1、目的：隨著近年來心臟外科、血管外科和神經外科等逐步突破原來被視為的“禁區(qū)手術”，給圍術期管理帶來極大的挑戰(zhàn)與機遇。長時間的體外循環(huán)，大血管阻斷以及失血性休克等造成的重要臟器缺血再灌注，特別是中樞神經系統(tǒng)圍術期缺血再灌注損傷，已成為圍術期早期死亡和長期預后不良的重要危險因素。雖然圍術期管理醫(yī)生，特別是麻醉醫(yī)生，在不斷研發(fā)和利用各種藥物或設備提高腦組織對血流減少或阻斷后的耐受力，減少血管再通血流恢復灌注后所導致的神經功能再受損，但由于中樞神

2、經系統(tǒng)分子信號的復雜調控，以及神經元的不可再生性，圍術期腦保護的研究一直未取得顯著地進展。當今圍術期管理腦保護的重大課題之一則是提高神經元缺氧耐受性，減少缺血再灌注造成的神經功能受損。由于缺血再灌注損傷缺乏預見性，各種藥物或設備的后處理則被認為能夠有效減輕中樞神經系統(tǒng)缺血再灌注損傷的方法。最近，在動物實驗和臨床試驗中已發(fā)現，低濃度的吸入性麻醉藥物七氟烷，能夠顯著改善缺血心肌和腦組織的細胞損傷與凋亡，提高生存率。然而，七氟烷后處理對神經元

3、遭受缺血再灌注損傷的保護機制卻始終未有重大進展，而闡明其神經保護機制則有助于研發(fā)新型靶向藥物。因此，從新的角度和方向來進一步探討七氟烷后處理對中樞神經系統(tǒng)再灌注的保護機制具有重要意義。
　　方法：9-10周齡SD大鼠，體重350-400g。根據隨機數字表法，將其分為7組(n=5):正常對照組（control group，C）;心肺復蘇模型組（CPR group，H）;心肺復蘇+七氟烷后處理組(SEVO+CPR group;SH);

4、心肺復蘇+七氟烷后處理+PD98059組(SEVO+CPR+PD group; SHP);七氟烷后處理組(SEVOgroup; S); PD98059組(PDgroup;P);心肺復蘇+PD98059組（CPR+PD group;HP）。SHP組、P組和HP組腦室內注射PD98059（30μg/kg），H組、SH組、SHP組和HP組大鼠應用氣管導管夾閉法心搏驟停法（窒息法）模擬全腦缺血再灌注動物模型，其中氣管導管夾閉的窒息時間為10mi

5、n。SH組、SHP組和S組大鼠心肺復蘇成功后呼吸機輔助呼吸2h，同時吸入2％七氟烷作為后處理。心肺復蘇成功后72 h，采用神經功能缺陷評分法評價大鼠神經功能受損情況;心肺復蘇成功24 h后，將各組大鼠處死并行生理鹽水灌注，分離大腦皮質，采用免疫蛋白印跡法測定磷酸化Erk1/2和總磷酸化Erk1/2表達;采用透射電鏡法觀察腦皮質線粒體的超微結構;采用TUNEL免疫熒光染色，評價神經細胞的凋亡率;采用氧電極法測定皮質線粒體呼吸功能，評價線粒

6、體功能狀態(tài);采用實時定量PCR法和免疫蛋白印記法，測定大鼠皮質Bid、Bim和Puma的表達，評價促凋亡因子的表達水平。出生24小時內的SD大鼠，進行原代皮質神經元培養(yǎng)，并根據隨機數字表法將所培養(yǎng)的神經元分為7組(n=5):正常對照組（control group;C）;氧糖剝奪模型組（Oxygen-Glucose Deprivation/Resuscitation[OGD/R] group;O）;氧糖剝奪+七氟烷后處理組(Sevoflu

7、rane+OGD/R group;SO);氧糖剝奪+七氟烷后處理+PD98059組（Sevoflurane+OGD/R+PD group; SOP）;七氟烷后處理組(SEVOgroup; S); PD98059組（PD group;P）;氧糖剝奪+PD98059組（OGD/R+PD group; OP）。SOP組、P組和HP組在氧糖剝奪前1h向培養(yǎng)基中加入PD98059(30μM/L)，O組、SO組、SOP組和OP組神經元進行氧糖剝奪-

8、復糖復氧，其中氧糖剝奪90 min，復糖復氧24 h，模擬全腦缺血再灌注的細胞模型。SO組、SOP組和S組在氧糖剝奪90min后，更換為正常神經元培養(yǎng)基，同時在含有2％七氟烷的培養(yǎng)箱中孵育2h。按照各組處理24 h后，0.125％胰蛋白酶處理收獲神經元，利用免疫蛋白印跡法測定磷酸化Erk1/2和非磷酸化Erk1/2;利用AnnexinⅤ-FITC/PI染色，應用流式細胞學法測定雙染神經元，評價神經元凋亡率;利用MTT法測定神經元生存率;

9、利用JC-1免疫熒光探針法，測定紅色/綠色熒光比，檢測線粒體膜電位水平(MMP)，評價線粒體結構功能變化;利用熒光素-熒光素酶試劑盒測定神經元內ATP含量;利用實時定量PCR法和免疫蛋白印記法，測定大鼠皮質神經元中促凋亡因子Bid、Bim和Puma的表達水平。出生24小時內的SD大鼠，進行原代皮質神經元培養(yǎng)，并根據隨機數字表法將所培養(yǎng)的神經元分為4組(n=5):正常對照組（control group;C）;氧糖剝奪模型組(OGD/Rgr

10、oup;O);氧糖剝奪+七氟烷后處理組(Sevoflurane+OGD/R group;SO);氧糖剝奪+七氟烷后處理+PD98059組（Sevoflurane+OGD/R+PD group; SOP）;七氟烷后處理組（Sevoflurane group;S）。處理同以上實驗。分別于開始復糖復氧的0h、2h、4h、8h、12 h和24 h，使用0.125％胰蛋白酶收獲各組原代大鼠皮質神經元，通過離心濾過法分離大鼠皮質神經元線粒體、細胞質

11、和細胞核，采用免疫蛋白印跡法分別測定大鼠皮質神經元線粒體、細胞質和細胞核磷酸化Erk1/2以及總磷酸化Erk1/2的表達。出生24小時內的SD大鼠，進行原代皮質神經元培養(yǎng)，并根據隨機數字表法將所培養(yǎng)的神經元分為12組(n=5):正常對照組（control group;C）;氧糖剝奪模型組（OGD/Rgroup;O）;氧糖剝奪+七氟烷后處理組（SEVO+OGD/R group;SO）;氧糖剝奪+環(huán)孢菌素A處理組（CSA+OGD/R gro

12、up;CO）;氧糖剝奪+七氟烷后處理+蒼術苷組（SEVO+OGD/R+ATR group;SOA）;氧糖剝奪+七氟烷后處理+PD98059組（SEVO+OGD/R+PD group;SOP）;七氟烷后處理組(SEVO group;S);蒼術苷處理組(ATR group; A);環(huán)孢菌素A處理組（CSA group; CS組）;氧糖剝奪+蒼術苷處理組(OGD/R+ATR group;OA);氧糖剝奪+PD98059組(OGD/R+PD g

13、roup;OP)。氧糖剝奪90 min，復糖復氧2h后，使用0.125％胰蛋白酶收獲各組原代大鼠皮質神經元。根據線粒體提取試劑盒說明，利用離心濾過法將大鼠皮質神經元中的線粒體分離出后，采用免疫蛋白印跡法分別測定大鼠皮質神經元線粒體磷酸化Erk1/2和總磷酸化Erk1/2的表達，利用AnnexinⅤ-FITC/PI染色，應用流式細胞學法測定雙染神經元，評價神經元凋亡率;采用MTT法測定細胞生存率;利用分光光度儀測定提取的線粒體在OD540

14、nm處的吸收值，評價線粒體通道轉換孔的開放程度。
　　結果：心肺復蘇模型中，與C組比較，H組和SH組中皮質神經細胞p-Erk1/2占總Erk1/2比值的升高;與H組比較，SH組皮質神經細胞p-Erk1/2占總Erk1/2比值高于H組;與SH比較，SHP組皮質神經細胞p-Erk1/2占總Erk1/2比值下降(P＜0.05)。與C組比較，H組神經缺陷功能評分降低，線粒體超微結構紊亂，神經細胞凋亡率升高，線粒體呼吸控制率下降，促凋亡因子

15、Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達明顯升高(P＜0.05);與H組比較，SH組神經缺陷功能評分上升，線粒體超微結構明顯完整，神經細胞凋亡率降低，線粒體呼吸控制率升高，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達明顯降低;與SH比較，SHP組神經缺陷功能評分降低，線粒體超微結構紊亂，神經細胞凋亡率升高，線粒體呼吸控制率下降，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達明顯升高(P＜0.05)。大鼠皮質神

16、經元氧糖剝奪-復糖復氧模型中，與C組比較，O組和SO組神經元p-Erk1/2占總Erk1/2比值升高;與O組比較，SO組神經元p-Erk1/2占總Erk1/2比值高于O組;與SO比較，SOP組神經元p-Erk1/2占總Erk1/2比值下降(P＜0.05)。與C組比較，O組神經元凋亡率升高，生存率下降，線粒體膜電位水平下降，神經元ATP含量下降，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達明顯升高(P＜0.05);與O組比較，

17、SO組神經元凋亡率下降，生存率升高，線粒體膜電位水平升高，神經元ATP含量升高，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達明顯降低(P＜0.05);與SO組比較，SOP組神經元凋亡率升高，生存率下降，線粒體膜電位水平下降，神經元ATP含量下降，促凋亡因子Bid、Bim和Puma mRNA和蛋白的表達明顯升高(P＜0.05)。線粒體中，與C組和S組比較，O組神經元經過氧糖剝奪-復糖復氧4h、8h后，線粒體中p-Erk1/2占

18、總Erk1/2比值升高(P＜0.05);與O組比較，SO組神經元在經過氧糖剝奪后復糖復氧2h、4h、8h、12h、18h和24 h，線粒體中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達升高(P＜0.05)。細胞質中，與C組和S組比較，在O組和SO神經元在經過氧糖剝奪后復糖復氧的2h、4h、8h、12h、18h和24h，細胞質中p-Erk1/2占總Erk1/2比值升高(P＜0.05);與O組比較，SO組神經元在經過氧糖剝奪后復糖復氧4h、8h

19、、12h、18h和24h，細胞質中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達升高(P＜0.05)。與C組和S組比較，在O組和SO神經元在經過氧糖剝奪后復糖復氧的2h、4h、8h、12h、18h和24 h，細胞核中p-Erk1/2占總Erk1/2比值升高(P＜0.05);與O組比較，SO組神經元在經過氧糖剝奪后復糖復氧2h、4h、8h、12h、18h和24 h，細胞核中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達升高(P＜0.05)。與C組比較

20、，O組大鼠原代皮質神經元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達升高，神經元生存率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉換孔開放程度升高(P＜0.05);與O組比較，SO組大鼠原代皮質神經元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達升高，神經元生存率升高，凋亡率下降，線粒體通道轉換孔開放程度下降(P＜0.05);與O組比較，CO組大鼠原代皮質神經元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達升高，神經元生存率升高，凋亡率下降，線粒體通道轉換孔開

21、放程度下降(P＜0.05);SO組和CO組大鼠原代皮質神經元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達，神經元生存率、凋亡率、線粒體通道轉換孔開放程度無明顯差異(P＞0.05);與SO組比較，SOA組大鼠原代皮質神經元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達下降，神經元生存率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉換孔開放程度升高(P＜0.05);與SO組比較，SOP組大鼠原代皮質神經元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達下降，神經元生存

22、率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉換孔開放程度下降(P＜0.05);與C組比較，S組、CA組、A組和P組大鼠原代皮質神經元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達，神經元生存率、凋亡率、線粒體通道轉換孔開放程度無明顯差異(P＞0.05);與O組比較，OA組大鼠原代皮質神經元中p-Erk1/2占總Erk1/2比值表達下降，神經元生存率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉換孔開放程度升高(P＜0.05);與O組比較，OP組大鼠原代皮質神經元中p-

23、Erk1/2占總Erk1/2比值表達下降，神經元生存率下降，凋亡率升高，線粒體通道轉換孔開放程度升高(P＞0.05)。
　　結論：⑴七氟烷后處理減輕心肺復蘇后全腦缺血再灌注損傷導致的神經細胞凋亡，改善神經功能的機制，可能與增加皮質細胞內Erk1/2磷酸化水平，抑制促凋亡因子Bid、Bim和Puma的表達，保護線粒體的形態(tài)以及呼吸功能相關。⑵七氟烷后處理減輕原代大鼠皮質神經元在氧糖剝奪-復糖復氧處理凋亡的機制，可能與七氟烷后處理提高